白細胞介素33及其受體ST2功能性多態位點與宮頸鱗癌的關聯分析

湯 容，黃 娟

(成都市婦女兒童中心醫院婦產科，四川成都 610091)

宮頸癌在女性中的癌癥發病率和病死率中均位居第4位。2018年，全球范圍內約有57.0萬新發病例，31.1萬死亡病例[1]。在我國，2014年宮頸癌新發病例10.2萬人，死亡3.0萬人[2]。宮頸癌的發病與人乳頭狀病毒(HPV)感染密切相關。Ⅱ型干擾素γ(IFN-γ) 作為一種細胞因子，在抗病毒免疫中發揮著至關重要的作用[3-5]。IFN-γ可誘導白細胞介素33(IL-33)的表達[6]，通過與其受體白細胞介素1受體樣1(ST2)結合參與抗病毒和抗腫瘤免疫應答[7]。文獻顯示，IFN-γ和IL-33在宮頸癌中低表達[4,6]，然而，ST2 mRNA在宮頸癌中的表達筆者未見研究報道。本研究采用病例對照探討位于IL-33/ST2的2個功能性多態位點與宮頸鱗癌的相關性，并運用熒光定量PCR檢測IL-33和ST2 mRNA在宮頸鱗癌中的表達，探討IL-33、ST2多態性與其表達的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經成都市婦女兒童中心醫院醫學理論委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。血液樣本：收集2013年8月至2018年4月成都市婦女兒童中心醫院239例宮頸鱗癌患者(病例組)和235例體檢健康女性(對照組)外周靜脈血。宮頸鱗癌診斷均經醫院病理科確診。病例組患者平均年齡(44.5±8.8)歲，對照組女性平均年齡(44.7±9.2)歲。根據國際婦產科協會1995年臨床分期標準對入選病例進行分期：Ⅰ期為宮頸癌局限在子宮；Ⅱ期為腫瘤超越子宮但未達骨盆壁或未達陰道下1/3；Ⅲ期為腫瘤擴展到骨盆壁和(或)累及陰道下1/3和(或)引起腎盂積水或腎無功能；Ⅳ期為腫瘤擴展到骨盆壁和(或)累及陰道下1/3和(或)引起腎盂積水或腎無功能或遠處轉移。病例組中Ⅰ期131例，Ⅱ期104例；高中分化癌87例，低分化癌148例；有淋巴結轉移者44例，無淋巴結轉移者191例。術前晨起空腹采集外周靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝，-20 ℃冰箱貯存備用。所有研究對象均為漢族人群，均未進行放化療治療。組織標本：收集成都市婦女兒童中心醫院55例宮頸鱗癌根治術患者的新鮮標本。患者年齡35～69歲，平均(51.0±8.7)歲。高分化鱗癌7例，中分化鱗癌30例，低分化鱗癌18例；臨床Ⅰ期24例，臨床Ⅱ期31例；有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移37例。所有患者術前均未進行放化療，宮頸鱗癌的診斷均經組織病理學確診。同時，收集癌組織5 cm以遠的癌旁組織作為對照，液氮快速冷凍后置于-80 ℃冰箱貯存備用。

1.2儀器與試劑 DNA提取試劑盒購自天根公司，基因分型探針購自美國ABI公司，Trizol 試劑購自美國賽默飛世爾公司，逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑購自美國應用生物系統公司，八連管購自美國Axygen公司，超微量紫外分光光度計購自美國賽默飛世爾公司，ABI7500熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統公司。

1.3多態位點選擇及基因分型 文獻顯示，IL-33 rs7025417能影響骨肉瘤患者IL-33 mRNA和蛋白的表達，并影響基因轉錄活性[8]；ST2 rs3821204 C和G等位基因與miR-202-3p的結合力不同，導致ST2 蛋白的表達不同[8-9]。基于以上原因，選擇IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204多態性進行研究。提取外周血DNA，超微量紫外分光光度計定量，Taqman探針法對IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204多態性進行分型。ABI公司中兩位點的探針編號分別為C_31940410_20 和 C_1226153_10。

1.4總RNA提取及cDNA逆轉錄 取凍存宮頸鱗癌和癌旁組織，Trizol法提取總RNA，按照操作說明書進行，具體步驟如下：約50 mg組織中加入1 mL Trizol，充分勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，加入200 μL氯仿，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，將上層水相移至一個新的離心管中，加入200 μL異戊醇，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇、干燥，加入50 μL DEPC水溶解RNA。超微量紫外分光光度計檢測A260/A280比值，以確定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA，運用隨機引物逆轉錄為cDNA,具體操作按照逆轉錄試劑盒說明書進行。反應體系為20 μL，含5×反應緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，dNTP 2 μL，逆轉錄酶1 μL，隨機引物1 μL和RNA 1 μg。反應條件為：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。

1.5熒光定量PCR 運用SYBRG熒光定量PCR檢測IL-33和ST2 mRNA在55例宮頸鱗癌樣本中的表達。參照文獻[9-10]中引物，序列如下,IL-33上游：5′-ATC CCA ACA GAA GGC CAA AG-3′，IL-33下游：5′-CCA AAG GCA AAG CAC TCC AC-3′；ST2 上游：5′-GGA TTG AGG CCA CTC TGC TC-3′，ST2下游：5′-CCG CCT GCT CTT TCG TAT GT-3′。 β-肌動蛋白(β-actin)作為內參，上游：5′-TTG CCG ACA GGA TGC AGA A-3′，下游：5′-GCC GAT CCA CAC GGA GTA CT-3′。引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。八連管中配制如下10 μL反應體系：2×SYBR Green 5 μL，10 μmol/L上游和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，RNA free水2 μL。ABI7500熒光定量PCR儀上設置如下反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。每個樣本設3個復孔，電腦自動生成擴增曲線，并記錄循環閾值(Ct)。采用2-ΔΔCt表示目的基因IL-33和ST2 mRNA的相對表達量。

1.6統計學處理 運用SPSS13.0 進行統計學分析。采用χ2檢驗分析哈迪溫伯格遺傳平衡。非正態分布數據以中位數表示。IL-33 rs7025417、ST2 rs3821204多態性與宮頸鱗癌的關聯性比較采用χ2檢驗，以OR和95%CI表示相對風險，OR值經年齡和HPV調整。正態性檢驗分析IL-33/ST2 mRNA表達數據分布特征，宮頸鱗癌和癌旁組織中的相對表達量比較采用Mann-WhitneyU檢驗，并進行Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204多態性與宮頸鱗癌的相關性 IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204多態性在對照組和病例組中的分布頻率符合哈迪溫伯格遺傳平衡(rs7025417位點：χ2=2.21、0.33，P=0.140、0.570；rs3821204位點：χ2=0.38、0.32，P=0.540、0.570)。IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204多態性與宮頸鱗癌的相關性比較見表1。rs7025417位點：CC基因型和C等位基因均降低了宮頸鱗癌的發病風險(CCvs.TT:調整OR=0.54，95%CI：0.33～0.90，P=0.020；Cvs.T:調整OR=0.73，95%CI：0.57～0.95，P=0.020)。rs3821204多態性與宮頸鱗癌的發病無關。

表1 IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204多態性與宮頸鱗癌的相關性

2.2IL-33/ST2 mRNA在宮頸鱗癌中的表達 由于IL-33、ST2 mRNA表達數據呈非正態分布，因此，數據以中位數表示。宮頸鱗癌組織中IL-33 mRNA的相對表達量為0.001 0，明顯低于癌旁組織中的相對表達量0.004 0，差異有統計學意義(P=0.002)，見圖1A。宮頸鱗癌組織中ST2 mRNA的相對表達量為0.020 0，明顯低于癌旁組織中的相對表達量0.030 0，差異有統計學意義(P=0.020)，見圖1B。根據年齡、宮頸鱗癌分化程度、臨床分期和淋巴結轉移等臨床特征進行亞組分析，結果顯示，IL-33和ST2 mRNA表達與上述臨床特征無明顯相關性(P>0.05)。

注:A為IL-33 mRNA相對表達量；B為ST2 mRNA相對表達量

圖1IL-33、ST2mRNA在宮頸鱗癌和癌旁組織的表達

2.3IL-33 mRNA與ST2 mRNA相關性分析 對宮頸鱗癌組織中IL-33 mRNA與ST2 mRNA表達量進行相關性分析，發現兩者存在正相關關系(r=0.52，P<0.001)，見圖2。

圖2 IL-33 mRNA和ST2 mRNA表達量相關性分析

2.4rs7025417和rs3821204多態性對IL-33、ST2 mRNA表達量的影響 55例宮頸鱗癌組織樣本中，rs7025417TT基因型20例，CT基因型26例，CC基因型9例。攜帶rs7025417CC基因型的宮頸鱗癌患者中IL-33 mRNA相對表達量為0.000 2，明顯低于rs7025417TT基因型攜帶者(P=0.030)，見圖3A。rs3821204各基因型不影響ST2 mRNA的表達量，見圖3B。

注：A為IL-33 mRNA相對表達量；B為ST2 mRNA相對表達量

圖3rs7025417和rs3821204多態性對IL-33、ST2mRNA表達量的影響

3 討 論

研究已經證實，HPV感染是宮頸癌發病的危險因素之一。臨床上把檢測HPV感染狀態作為宮頸癌的早期篩查手段，有助于早期診斷和治療，降低病死率[11-14]。IFN-γ主要由活化的T細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等細胞分泌，宮頸癌中IFN-γ mRNA呈低表達[4]，在多個層面發揮抗病毒抗腫瘤作用[15-16]。除此之外，IFN-γ尚可誘導分泌一些細胞因子，如IL-33。IL-33屬于IL-1家族，是一種具有雙重功能的免疫調節因子。IL-33在肺癌中具有癌基因的作用，通過上調金屬基質蛋白酶2和9的表達促進細胞侵襲和遷移[17]。相反，IL-33在結腸癌等腫瘤中具有抑癌基因的作用，通過活化CD8+T細胞和自然殺傷細胞抑制腫瘤生長[18-19]。宮頸癌中，有學者觀察到IL-33 mRNA表達明顯降低[6]，由于檢測標本僅有15例，有必要擴大樣本量驗證文獻報道結果。本研究運用熒光定量PCR檢測55例宮頸鱗癌中IL-33 mRNA的表達，發現癌組織中IL-33 mRNA的相對表達較癌旁組織降低了約4倍，提示IL-33在宮頸癌中發揮著抑癌基因的作用。

IL-33發揮作用是通過與其受體ST2結合實現的，ST2基因敲除小鼠鱗狀細胞癌組織中IFN-γ表達明顯下降[20]，由此形成一個正反饋回路：IFN-γ誘導IL-33表達，IL-33結合ST2，ST2反過來又刺激IFN-γ的表達。查閱文獻，未發現宮頸癌中ST2基因表達變化的研究報道。本研究首次發現宮頸癌中ST2 mRNA表達明顯降低。由于IL-33、ST2反饋回路的存在，推測兩者可能存在一定的關聯性。相關性分析證實了該猜測，結果顯示，IL-33與ST2呈顯著正相關關系，提示IL-33和ST2可能相互協調參與宮頸癌的發生發展。

關于IL-33、ST2與腫瘤的關系，WANG等[8]報道IL-33 rs7025417 CC基因型降低了骨肉瘤的發病風險，C等位基因通過破壞與轉錄因子c-Myc的結合進而降低轉錄活性和IL-33的表達。WEI等[9]報道ST2 rs3821204 CC基因型增加了肝癌的發病風險，可能原因是在轉錄和翻譯水平增加了ST2的表達。查閱文獻，未見IL-33、ST2多態性與宮頸癌風險的相關性報道。本研究運用探針法調查IL-33 rs7025417和ST2 rs3821204在239例宮頸癌和235例健康女性中的分布，發現rs7025417 CC基因型降低了宮頸鱗癌的發病風險。為探索其可能原因，本研究對比分析了 rs7025417和rs3821204基因型與IL-33、ST2 mRNA表達的關系，發現rs7025417 CC基因型宮頸鱗癌患者中IL-33 mRNA水平明顯降低，與骨肉瘤文獻中報道一致[8]，提示rs7025417 CC降低宮頸鱗癌發病風險的可能原因是抑制了IL-33 mRNA的表達。

4 結 論

本研究首次發現rs7025417 CC基因型可能通過降低IL-33 mRNA的表達進而降低宮頸鱗癌的發病風險，并且IL-33與ST2基因表達存在正相關關系，提示IL-33、ST2正反饋回路可能參與宮頸癌的演變過程。針對上述基因的干預可能為宮頸癌的靶向治療提供思路，有助于完善宮頸癌的治療方案并改善總體預后。