血清半乳糖血凝素-1、緊密連接蛋白-1對甲狀腺癌病情評估的價值

徐 斌，應 紅

(重慶市急救醫療中心核醫學科,重慶 400014)

甲狀腺癌是全世界常見的內分泌腫瘤之一，包括甲狀腺乳頭癌和甲狀腺濾泡癌，前者是最常見的甲狀腺癌，極少發生淋巴轉移，預后較好；后者更具侵襲性，惡性程度較高[1]。甲狀腺腺瘤是起源于甲狀腺濾泡的良性腫瘤，切除后即可治愈,預后良好。目前，刺針穿刺活檢是常見的鑒別診斷甲狀腺腫瘤的方法，但用組織病理學鑒別甲狀腺癌與良性腫瘤，甲狀腺乳頭癌和甲狀腺濾泡癌的亞型仍存在一定誤差[2]，需結合甲狀腺癌篩查的血清指標，以增加靈敏度及特異度。半乳糖血凝素-1(Gal-1)是一種缺氧誘導因子，作為真核細胞里缺氧應答的關鍵性轉錄調節因子，在腫瘤形成過程中起主要作用[3]。緊密連接蛋白-1(Cla-1)屬于跨膜蛋白家族，在細胞黏附和上皮細胞極性中具有關鍵作用[4]。以往研究表明，Gal-1和Cla-1在正常組織和腫瘤組織中表達差異較大，但在血清中表達差異的研究較少。本文將探討甲狀腺癌患者血清中Gal-1和Cla-1表達情況，為甲狀腺癌早期診斷和篩查提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經本院醫學倫理委員會批準(2015011)，且患者均簽署知情同意書。選取2015年1月至2017年9月本院收治的104例甲狀腺疾病患者，經患者知情同意后，臨床治療前清晨空腹采集靜脈血2 mL，低速離心機 4 ℃ 4 000 r/min離心15 min，分離獲得血清，手術切除甲狀腺疾病組織標本于-80 ℃冰箱保存。按2004年WHO病理組織學分類標準，其中甲狀腺乳頭癌32例，男6例，女26例，平均年齡(47.76±6.54)歲；甲狀腺濾泡癌18例，男3例，女15例，平均年齡(49.21±8.34)歲；甲狀腺腺瘤54例，男10例，女44例，平均年齡(50.42±7.24)歲。同時，隨機選取20例甲狀腺功能各指標、甲狀腺彩超均正常的志愿者為對照組，男10例，女10例，平均年齡(46.64±6.54)歲，收集其血清標本。以上病例均經病理學確診。

1.2主要試劑 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Sigmag公司，兔抗人Gal-1、Cla-1單克隆抗體購自英國Abcam公司，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，山羊抗兔二抗購自武漢博士德。PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白提取試劑盒購自上海碧云天。Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和qRT-PCR檢測試劑盒均購自Takara。PCR引物自行設計并交由上海生工合成。

1.3方法

1.3.1ELISA檢測血清Gal-1、Cla-1的水平 將凍存血清復溫，每批檢測設空白、陰性對照各2孔，嚴格按照說明書進行操作。在TECAN Safire全自動酶標分析儀上450 nm處讀取吸光度(A)值，每孔測定3次，取均值。參照試劑盒操作步驟與方法繪制標準曲線，并求水平與吸光度的回歸方程，依據標準曲線和回歸方程確定各樣品Gal-1、Cla-1的水平。

1.3.2Western bolt檢測組織中Gal-1和Cla-1蛋白水平 將對照組甲狀腺組織和各組甲狀腺癌組織用RIPA裂解細胞后提取組織蛋白，采用BCA法測定蛋白水平，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液(5×)沸水浴15 min使蛋白變性。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜至硝酸纖維膜。用5% BSA封閉2 h后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。吸棄一抗，TBST洗膜，15 min/次，共3次，然后用TBST稀釋二抗(1∶2 000)，室溫雜交1 h。同前洗膜3次后室溫下ECL顯色，以GAPDH(1∶200)作為內參。Image J軟件分析確定雜交條帶的相對灰度值。

1.3.3qRT-PCR檢測組織Gal-1、Cla-1和腫瘤組織惡性行為基因表達 分別取約50 mg甲狀腺癌組織置于2 mL EP管中，加入1 mL Trizol 用組織勻漿機劇烈勻漿5 min，將勻漿液轉移到EP管中加入200 μg氯仿混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min取上清，加入等體積的異丙醇混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清，用800 μL 75%的乙醇洗滌，待乙醇揮發后加入50 μL的DEPC水溶解備用。取RNA溶解定量后，取2 μg RNA 37 ℃反轉錄1 h。使用qRT-PCR檢測試劑盒檢測基因的表達。擴增管家基因GAPDH作內對照。反應條件為：95 ℃ 5 min，1個循環；95 ℃ 30 s、56 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，40個循環。以IQ5.0軟件對PCR數據進行統計學分析，以各組目的基因表達水平與內參的比值為該基因的校正表達水平。擴增目的基因mRNA如下：細胞增殖促進基因EDAG-1、Survivin、CCNG2；腫瘤侵襲基因:STAT3、FAK、Beclin-1。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結 果

2.1血清Gal-1、Cla-1水平的比較 4組研究對象性別差異有統計學意義(P<0.05)，年齡差異無統計學意義(P>0.05)。4組血清Gal-1(Z=76.65，P<0.000)、Cla-1(Z=58.64，P<0.000)水平差異均有統計學意義，其中甲狀腺乳頭癌組血清Gal-1和Cla-1水平均高于甲狀腺濾泡癌組、甲狀腺腺瘤組、對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；甲狀腺濾泡癌血清Gal-1和Cla-1水平均高于甲狀腺腺瘤組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組相比，甲狀腺腺瘤組Gal-1水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清Gal-1、Cla-1水平比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與甲狀腺腺瘤相比，bP<0.05；與甲狀腺濾泡癌相比，cP<0.05

2.2甲狀腺癌組織中Gal-1、Cla-1 mRNA和蛋白的表達 qRT-PCR和Western bolt結果顯示，與對照組相比，甲狀腺乳頭癌組、甲狀腺濾泡癌組、甲狀腺腺瘤組的組織中Gal-1、Cla-1 mRNA水平和蛋白顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A表示 Gal-1 和 Cla-1 mRNA表達水平；B表示Gal-1 和 Cla-1 蛋白表達水平；C表示Gal-1和Cla-1蛋白分析結果；與對照組比較，*P<0.05

圖1Gal-1、Cla-1在組織中的表達

注：A為CCNG2；B為EDAG-1；C為Survivin；D為STAT3；E為FAK；F為Beclin-1；與對照組相比，*P<0.05

圖2腫瘤組織中腫瘤細胞增殖促進基因和腫瘤侵襲基因mRNA表達情況

2.3腫瘤組織中腫瘤細胞增殖促進基因和腫瘤侵襲基因mRNA表達 qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，甲狀腺癌患者腫瘤細胞增殖促進基因EDAG-1、Survivin mRNA表達量均顯著升高(P<0.05)，CCNG2 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。甲狀腺癌患者腫瘤組織中腫瘤侵襲基因STAT3、FAK mRNA相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組相比，甲狀腺乳頭癌組、甲狀腺濾泡癌組、甲狀腺腺瘤組Beclin-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見圖2。

2.4血清Gal-1、Cla-1和腫瘤增殖與腫瘤侵襲基因之間的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，甲狀腺癌患者的血清Gal-1與EDAG-1、Survivin、FAK呈明顯正相關關系，與CCNG2、Beclin-1呈明顯負相關關系，而與STAT3無明顯相關性(r=0.13,P=0.928);血清Cla-1與Survivin、STAT3、FAK呈明顯正相關關系，與CCNG2、Beclin-1呈明顯負相關關系,而與EDAG-1無明顯相關性(r=0.164,P=0.301)。見表3。

表3 血清Gal-1、Cla-1和腫瘤增殖與腫瘤侵襲基因之間的相關性分析

注：a表示呈顯著正相關關系；b表示呈顯著負相關關系

3 討 論

無痛性甲狀腺結節是甲狀腺癌常見的臨床表現之一，研究表明，高達50%的普通人群可能患有甲狀腺結節。臨床上常使用細針穿刺、觸診、超聲、CT、MRI等檢測方法對甲狀腺結節進行診斷分類，但這些方法都存在不同缺陷[5]。因此，尋找一種甲狀腺疾病血清生物標志物，對甲狀腺癌的早期篩查、評估甲狀腺癌的轉移及進展具有重要意義。

本研究發現，甲狀腺癌中腫瘤惡性程度越高，血清中的Gal-1、Cla-1水平越高。WU等[6]研究發現，甲狀腺癌患者血清Gal-1在Ⅲ期和Ⅳ期中顯著升高，且與患者淋巴結轉移有關。ARCOLIA等[7]研究指出，Gal-1在69例甲狀腺病變的上皮內完全消失，而在惡性甲狀腺細胞的細胞質中顯著增加。SALAJEGHEH等[8]研究報道，Gal-1蛋白在32%的原發性甲狀腺乳頭狀癌中過表達，53%轉移性乳頭狀甲狀腺癌的淋巴結中表達顯著增加，47%的原發性轉移的淋巴結也顯著增加，在淋巴結轉移的乳頭狀甲狀腺癌中Gal-1蛋白過度表達。PALACIOS-CORONA等[9]研究表明，石蠟包埋的甲狀腺腺瘤、濾泡和乳頭狀癌的Gal-1相對附著水平均高于對照組，并在腺瘤黏附細胞的平均值與濾泡和乳頭狀癌樣本之間發現顯著差異。本研究發現，甲狀腺乳頭癌中Gal-1表達顯著高于對照組，甲狀腺癌中Gal-1高于良性腫瘤，與以上研究結果一致；各組中女性患者人數多于男性且差異有統計學意義，可能與甲狀腺癌女性多發有關。

SUREN等[10]研究報道，在甲狀腺惡性腫瘤和良性腫瘤中Cla-1差異具有顯著性，與對照組相比，乳頭狀癌和濾泡狀癌中Cla-1表達差異有統計學意義，該報道和本文結果一致。ZWANZIGER等[11]對淋巴結轉移組織分離的FTC-133細胞和從肺轉移的FTC-238細胞進行體外實驗發現，與FTC-133細胞相比，FTC-238細胞核中Cla-1蛋白表達顯著性升高，并且FTC-133細胞中Cla-1的過表達可能受磷酸化影響而導致細胞遷移和侵襲的增加。提示細胞核中Cla-1磷酸化活性改變可能是影響甲狀腺癌發生、發展的機制之一。

高表達的Gal-1、Cla-1可以證實其與甲狀腺癌發生、發展有關，但并不能說明其與腫瘤惡性行為的內在聯系。腫瘤細胞的增殖和侵襲是特異性改變，也是惡性改變發生、發展的基礎，本文分析了甲狀腺癌和甲狀腺腺瘤患者血清Gal-1和Cla-1水平與癌癥細胞增殖促進基因和腫瘤侵襲基因的mRNA表達量的相關關系，發現兩者存在一定的相關關系。CCNG2、EDAG-1、Survivin均是已有文獻報道的甲狀腺癌增殖相關基因。王倩倩等[12]研究發現，CCNG2基因可通過上調P53基因表達水平，抑制甲狀腺乳頭癌K1細胞增殖、促進細胞凋亡作用。CHEN等[13]研究發現，EDAG-1的過度表達促進了人類甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和黏附。Survivin是凋亡抑制蛋白，大量研究表明其在惡性腫瘤組織中表達很高，而在健康成人組織中表達極低[14]。

STAT3、FAK、Beclin-1作為腫瘤侵襲基因可直接影響腫瘤細胞的轉移能力，其異常表達是腫瘤惡性病變的重要原因。STAT3是信號轉導子與轉錄激活子家族的重要成員，研究表明其可通過促進MMP2的表達，改變細胞與細胞外基質間的黏附能力，促進腫瘤內皮細胞的遷移和新生血管的形成，為腫瘤轉移打開通道[15]。FAK是胞內的重要信號分子，介導細胞內信號網絡系統的交聯，在肝癌、胃癌、甲狀腺癌研究中發現，侵襲性腫瘤和伴有轉移的腫瘤FAK基因表達增加[16]。Beclin-1是哺乳動物參加自噬的雙等位抑癌基因，可通過參與調節惡性腫瘤的自噬活性在腫瘤的發生、發展中起重要作用[17]。本研究發現，血清Cla-1和Cla-1與甲狀腺癌組織CCNG2、EDAG-1、Survivin、STAT3、FAK、Beclin-1有一定的相關關系，提示Gal-1和Cla-1可能與甲狀腺腫瘤的惡性病變有關。

4 結 論

甲狀腺癌患者血清Gal-1和Cla-1水平顯著升高，并與甲狀腺癌惡性程度直接相關，血清Gal-1和Cla-1可以作為甲狀腺癌的輔助診斷因子，以提高甲狀腺癌的早期檢出率,具體的分子作用機制值得進一步研究。