呼吸道九聯檢與七聯檢在500例患者中的檢測結果分析

谷 雷，谷 峰，陳璐璐，解燕川，李武威，齊媛媛，李晶晶△

(河南科技大學臨床醫學院/河南科技大學第一附屬醫院：1.中心實驗室;2.頜面外科;3.檢驗科，河南洛陽 471000)

呼吸道感染包括上呼吸道和下呼吸道感染，下呼吸道感染多由上呼吸道感染不規范治療，久治不愈遷延所致。多發于小兒及老年人，嚴重影響小兒身心健康及成長，給對老年人生活也帶來諸多不便。90%以上呼吸道感染由病毒引起，其中甲型流感病毒(IFVA)，乙型流感病毒(IFVB)，腺病毒(ADV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，副流感病毒1、2、3型(PIVI 、PIV2、PIV3)最為常見[1]。目前,實驗室對呼吸道感染的檢測方法主要有2種[2]：一是采集靜脈血血清中病原體特異性抗體IgM檢測(九聯檢)；二是采集鼻咽部分泌物脫落細胞病毒抗原檢測(七聯檢)。2種檢測方法均可以同時檢測多種病原，快速準確，為臨床診斷節省時間，減少沒有針對性的盲目用藥率。為探討2種檢測方法在臨床實驗室的實際應用價值，本研究小組對本院500例呼吸道感染患者同時進行九聯檢與七聯檢，并對檢測結果進行統計分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年10月至2018年3月于本院就診的500例呼吸道感染患者為研究對象，分別來自兒科、呼吸內科及血液科。其中男326例，女174例。年齡1～12歲456例，平均(3.96±2.57)歲；13～18歲6例，平均(13.17±2.16)歲；>18歲38例，平均(59.62±5.14)歲。所選患者均具有呼吸道感染的臨床癥狀及體征，由臨床醫生根據相關診斷標準診斷為呼吸道感染[3]。

1.2研究方法

1.2.1檢測方法 同時采用九聯檢和七聯檢對患者進行檢測，九聯檢使用間接免疫熒光法(IFA)，檢測項目包括嗜肺軍團菌(LP)、肺炎支原體(MP)、Q熱立克次體(COX)、肺炎衣原體(CP)、IFVA、IFVB、ADV、RSV、PIV1、PIV2、PIV3。七聯檢采用直接免疫熒光法(DFA)，檢測項目包括IFVA、IFVB、ADV、RSV、PIV1、PIV2、PIV3。

1.2.2標本采集 (1)采用無菌真空干燥采血管采集患者靜脈血2 mL。(2)采用專用無菌咽拭子采集鼻咽部分泌物含鼻咽部脫落細胞。

1.2.3標本處理 嚴格按照試劑盒說明書進行操作。(1)靜脈血2 mL，3 500 r/min，離心10 min，用PBS對血清進行1∶1稀釋，取透明干燥試管1支，依次加入100 μL PBS緩沖液，100 μL血清，充分混勻。用吸附劑對稀釋后的樣本進行吸附，取透明干燥試管1支，依次加入150 μL吸附劑，30 μL稀釋后的樣本血清，充分混勻，3 000 r/min，離心10 min。制片，取1張包被有病原體抗體的載玻片，每孔依次加入15 μL處理過的上清，前9孔依次為LP、MP、COX、CP、ADV、RSV、IFVA、IFVB、PIV1、PIV2和PIV3，第10孔為質控孔。放入濕盒，37 ℃水浴箱孵育90 min。洗片，用PBS緩沖液流水緩慢沖洗孵育后的載玻片，然后用PBS緩沖液浸泡5 min(搖床搖動)。加異硫氰酸熒光素(FITC)結合物，用吸水紙將載玻片四周吸干，自然晾干，每孔依次加入15 μL FITC結合物，放入濕盒，37 ℃水浴箱孵育30 min。用PBS緩沖液緩慢沖洗孵育后的載玻片，然后浸泡5 min(搖床搖動)。封片，用吸水紙將載玻片四周吸干，自然晾干，每孔依次加入封片介質，加蓋蓋玻片[4]。(2)采集后的咽拭子，加入2 mL標本采集液，采集刷頭與采集液充分混勻，漩渦震蕩1 min，棄刷頭，3 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入2 mL細胞保存液，充分混勻，漩渦震蕩1 min，3 000 r/min，離心10 min，棄上清，留200 μL于管底，用加樣槍吹打混勻，制成細胞懸液。制片，取專用8孔載玻片1張，每孔依次加入25 μL細胞懸液，40 ℃下將玻片風干，4 ℃下丙酮固定5 min，每孔依次加25 μL抗體與FITC的結合物，前7孔依次為IFVA、IFVB、ADV、RSV、PIV1、PIV2和PIV3，第8孔為空白對照孔。放入37 ℃溫箱孵育15 min。洗片，用PBS緩沖液流水沖洗2遍，將剩余的FITC結合物洗掉，40 ℃下將玻片風干。封片，每孔依次加入封片介質，加蓋蓋玻片。

1.2.4熒光顯微鏡觀察結果[5]分別將制好且封片的呼吸道九聯檢與七九聯檢的載玻片置于熒光顯微鏡載物臺上，調整熒光顯微鏡至400×，觀察結果。

2 結 果

2.1九聯檢和七聯檢2種檢測方法的結果比較 呼吸道九聯檢對不同病原體的檢測陽性率依次為LP(0.40%)，MP(23.60%)，COX(0.06%)，CP(0.20%)，ADV(4.60%)，RSV(3.00%)，IFVA(15.00%)，IFVB(13.00%)，PIV1、PIV2、PIV3(7.00%)。七聯檢對不同病原體的檢測陽性率依次為IFVA(26.00%)，IFVB(17.00%)，ADV(5.20%)，RSV(24.60%)，PIV1(0.06%)，PIV2(5.60%)，PIV3(7.60%)。PIV1、PIV2、PIV3的總體陽性率為12.60%。其中九聯檢和七聯檢2種檢測方法均包含的5類病原微生物的檢測陽性率結果比較，見表1。

表1 九聯檢和七聯檢對不同病原體的檢測陽性率結果比較[n(%)]

注：兩組方法同時檢測RSV，結果比較χ2=96.245，P<0.05；同時檢測IFVA，結果比較χ2=17.892，P<0.05；同時檢測PIVI 、PIV2、PIV3，結果比較χ2=8.247，P<0.05

2.2九聯檢和七聯檢2種檢測方法的陽性符合率 九聯檢與七聯檢的檢測結果進行比較，其陽性符合率依次為ADV(30.8%)，RSV(12.2%)，IFVA(57.7%)，IFVB(60.0%)，PIV1、PIV2、PIV3(23.8%)。九聯檢與七聯檢的檢測結果總符合率為36.2%。見表2。

表2 九聯檢和七聯檢2種檢測方法的陽性符合率結果比較

3 討 論

免疫熒光技術是將已知的抗原或抗體標記上熒光素(熒光標記物)，再用其作為分子探針檢查細胞內的相應抗原(或抗體)，它是建立在免疫學、生物化學和顯微鏡技術基礎發展起來最早的一種標記免疫技術[6-8]。該方法利用抗原抗體反應進行抗原或抗體物質的定位，在熒光顯微鏡下根據熒光標記復合物發出的熒光，判斷被檢測物質的來源、性質和部位[9]。

本研究結果顯示，九聯檢部分病原體的檢測陽性率明顯低于七聯檢呼吸道病原體的抗原檢測，差異有統計學意義(P<0.05)。七聯檢是檢測抗原，九聯檢是檢測抗體，一般來說抗原檢測的陽性率會低于抗體檢測，但這可能與九聯檢是對機體因病原體產生的抗體進行檢測，而不同患者用藥治療情況、檢測時間點不同，或病原體IgM抗體在不同患者血清中表達水平不同有關[10]，七聯檢是直接用咽拭子采集鼻咽部分泌物脫落細胞檢測病毒抗原，與抗體在體內表達不同的是其更直接。也有研究表明[11]，患者受呼吸道病原體感染后，可在發病后1周左右檢測到血清中產生的特異性IgM抗體，且在急性期呈持續升高趨勢。因此，檢測患者急性期血清特異性IgM抗體對診斷具有非常重要的意義。宋秦偉等[12]的研究顯示，急性期血清呼吸道病毒IgM檢測的陽性率低于抗原檢測陽性率，與本研究結果相似。

九聯檢和七聯檢2種檢測方法在實際工作中仍存在其各自的優缺點[13]，易受標本取樣及實驗員操作水平等因素的影響，在一定程度上具有互補作用。呼吸道九聯檢血清標本取樣簡便，臨床易于接受，除脂、溶血外，很少受標本取樣因素的影響，但易受抗體表達水平、玻片質量、實驗員以及實驗本身原理特性等因素的影響，進而造成其陽性檢出率的降低[14]。七聯檢取患者鼻咽部分泌物脫落細胞[15]，對其進行抗原檢測，其取樣方式不易于被臨床及患者接受，尤其是兒童，因此，取樣標本的合格與否非常重要，如果未取到合格的鼻咽部分泌物脫落細胞，則整個實驗很難成功。綜上所述，七聯檢最主要受標本是否合格的影響，其次易受實驗員操作水平等因素的影響。在實際工作中，采用2種檢測方法同時進行，不僅可以避免因病原體抗體表達的影響，還可以避免因2種實驗各自的缺點而產生的影響，以降低漏檢率。建議臨床對原因未明且有待查病因的呼吸道感染患者同時進行呼吸道九聯檢及七聯檢，以幫助臨床進一步明確診斷患者病因。

4 結 論

本研究采用免疫熒光法檢測患者呼吸道病原體感染情況，結合臨床資料進行比較分析顯示，血清特異性IgM抗體受血清學局限，九聯檢檢測陽性率在ADV、RSV、IFVA、IFVB及PIVI、PIV2、PIV3中顯著低于七聯檢，但對MP檢測仍具有非常重要的意義，其中LP、COX、CP 3項檢出率較低，可與其他實驗方法聯合應用以提高檢出率。七聯檢因人為取樣因素對標本質量的影響，具有一定的漏檢率，因此，七聯檢聯合應用九聯檢可提高病原體檢出率，對疾病的預防、診斷及治療均具有非常重要的臨床意義，為臨床合理選擇檢測方法，更好地解讀檢測結果提供依據。