黃芪多糖對人紅白血病K562細胞凋亡的影響

【摘 要】目的：探討黃芪多糖（簡稱APS）對人紅白血病K562細胞凋亡產(chǎn)生的影響。方法：經(jīng)流式細胞術(shù)來研究APS對人紅白血病K562細胞凋亡產(chǎn)生的影響，而APS在K562細胞之中對Caspase-3產(chǎn)生的影響可通過Caspase-3活性測定法進行檢測;經(jīng)Western blot以及RT-PCR對對照組（K562細胞）及APS組（通過200mg/L的APS進行48h誘導形成的K562細胞）之中的Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白進行表達。結(jié)果：APS組細胞凋亡數(shù)量相較于對照組更高，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.05;APS組K562細胞中的Caspase-3相較于對照組明顯增加，但IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達都顯示降低，而Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達均明顯增加，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.05;兩組在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表達無顯性差異，無統(tǒng)計學意義，P>0.05。結(jié)論：APS對人紅白血病K562細胞進行誘導凋亡可能是通過對Smac、Bax上調(diào)以及對IAP-1、Bcl-2下調(diào)來實現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】黃芪多糖;人紅白血病;K562細胞;凋亡

白血病是一種常見的惡性腫瘤，此癥使人類健康受到嚴重的威脅，白血病細胞在生長的過程中具有凋亡受阻、增殖失控以及分化障礙等特點[1]。而APS屬于黃芪的活性成分之一，其具有抗應激、降血壓、降血糖、強心以及抗病毒等功效，相關(guān)研究表明[2]APS能夠有效抑制多種惡性腫瘤，為了研究APS對人紅白血病K562細胞凋亡的影響，本次研究通過試驗檢測對APS組和對照組中的Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白進行表達，目的旨在研究APS對白血病治療的依據(jù)，現(xiàn)做如下報道。

1 一般資料以及主要方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞來源和培養(yǎng)

K562細胞主要來源于本地細胞庫，通過使用10%（體積分數(shù)）的胎牛血清（簡稱FBS）、100mg/L鏈霉素以及100U/mL青霉素所形成的RPMI培養(yǎng)基參與細胞培養(yǎng)，并置于5%（體積分數(shù)）的CO2培養(yǎng)箱之中進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37℃。

1.1.2 試劑

（1）FBS：杭州四季青有限公司生產(chǎn);

（2）Trizol試劑、RPMI培養(yǎng)基以及100bp DNA Marker：美國Invitrogen公司生產(chǎn);

（3）Taq DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒、dNTPs：日本TAKARA公司生產(chǎn);

（4）Annexin V-FITC/PI：碧云天生物科技有限公司生產(chǎn);

（5）化學發(fā)光試劑盒：美國Santa Cruz公司生產(chǎn);

（6）Colorimetric試劑盒、CaspACETM Assay System試劑盒：美國Promega公司生產(chǎn)。

1.2 實驗檢測

1.2.1 細胞凋亡檢測

收集對照組（K562細胞）及APS組（通過200mg/L的APS進行48h誘導形成的K562細胞）樣本，并對細胞數(shù)量進行計量。通過195μL的Annexin V-FITC結(jié)合也將收集的細胞進行重懸，然后向其中加入5μL的Annexin V-FITC，進行10min的避光孵育，離心5min，1000r/min，去除上清。并通過190μL的Annexin V-FITC再次對細胞進行重懸，然后向其中加入10μL的染色液（碘化丙啶），并于冰上對其進行避光孵育，然后通過上流式細胞儀完成凋亡細胞數(shù)量的計量。實驗的過程中需要設(shè)置3個平行樣本。

1.2.2 Caspase-3活性測定

將APS組和對照組中的K562細胞總蛋白進行提取，并對其進行定量。然后進行Caspase-3活性測定，測定方法需嚴格按照說明書規(guī)定操作，并將相應試劑依次加入到96孔板中使反應混合物得以制備完成。兩組各設(shè)3個復孔，并設(shè)置空白對照孔（不加蛋白）。然后向每孔加入2μL的AC-DEVA-PNA底物，避光培育，溫度設(shè)定為37℃，時間設(shè)定為4h，并對405nm位置的光密度值進行測定，同時將各組的平均值進行計算，將各組所得平均值檢出空白對照平均值所形成的差值來對Caspase-3活性進行表示。

1.2.3 Western blot及RT-PCR檢測

（1）Western blot檢測：將兩組K562細胞總蛋白進行提取，同時進行定量，應用Western blot法進行檢測。將β-actin當做內(nèi)參照。上樣量設(shè)定為100μg，Bcl-XL、Bcl-2、Bax、IAP-1、Smac、β-actin克隆抗體的稀釋度分別為100倍、150倍、150倍、100倍、150倍。并通過軟件對目的條帶同內(nèi)參照條帶之間的灰度比值進行分析。

（2）RT-PCR檢測：將兩組K562細胞總RNA進行提取，同時進行定量，完成cDNA第一條鏈的體外合成，并將cDNA當做模板來完成PCR反應，然后使用軟件對PCR擴增物的目的條帶同內(nèi)參照條帶之間的灰度比值進行分析。

1.3 觀察指標

本次研究選擇的觀察指標為Caspase-3、Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白。

1.4 統(tǒng)計學方法

此次研究在數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面使用的軟件版本為SPSS20.0，以（）表示計量資料，采用t檢驗，以率（%）表示計數(shù)資料，采用X2檢驗，當顯性差異出現(xiàn)時，有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 APS對人紅白血病K562細胞凋亡產(chǎn)生的影響

通過檢測，APS組中K562細胞凋亡數(shù)量為（3319.00±408.64）個，相較于對照組（104.84±19.17）個更多，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.05，t=14.2831。

2.2 APS對Caspase-3產(chǎn)生的影響

APS組Caspase-3活性為（0.349±0.032），相較于對照組Caspase-3活性（0.092±0.011）更高，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.05，t=4.7436。

2.3 APS對Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac表達產(chǎn)生影響

如表1～2，APS組K562細胞中的IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達相較于對照組都顯示降低，而Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達均明顯增加，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.05;兩組在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表達無顯性差異，無統(tǒng)計學意義，P>0.05。

3 討論

常規(guī)下細胞凋亡及增殖之間達到動態(tài)平衡時，可對機體穩(wěn)定性進行維持，而凋亡和增殖一旦出現(xiàn)失衡，將可能造成腫瘤產(chǎn)生[3]。而細胞凋亡受基因調(diào)控的影響較大，其中，Caspase家族便是關(guān)鍵分子，Caspase家族成員一般都具備半胱氨酸蛋白酶活性，Caspase-8以及Caspase-9在凋亡途徑中處于上游位置，而Caspase-3則屬于凋亡效應因子，Caspase家族形成的級聯(lián)激活共同導致細胞凋亡出現(xiàn)[4]。

對于Caspase家族激活方面，Bcl-2家族在對其激活過程中能夠發(fā)揮調(diào)控作用，其屬于一種蛋白因子，在參與細胞凋亡調(diào)控過程中，具體以線粒體這一途徑來實現(xiàn)調(diào)控的[5]。從Bcl-2家族在細胞凋亡方面發(fā)揮的作用來看，其家族蛋白通常可分兩類，分別為促進凋亡蛋白（Bax等）和抑制凋亡蛋白（Bcl-XL、Bcl-2等），后者能夠?qū)毎霈F(xiàn)的凋亡進行抑制，從而使細胞的壽命得到延長，而前者則能夠使Caspase家族得以激活，從而造成細胞凋亡產(chǎn)生[6]。此外，還有研究表明[7]，Smac能夠同IAPs之間進行結(jié)合從而使Caspase得以釋放，最終促進細胞凋亡;而XIAP、Livin則能夠使Smac釋放減少，從而使細胞凋亡被抑制[8]，為此，此次研究特將上述指標加入到研究之中，以明確APS對K562細胞凋亡發(fā)揮的機制影響。

本次研究中，APS組細胞凋亡數(shù)量多于對照組，且APS組K562細胞中的Caspase-3相較于對照組明顯增加，但IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達都顯示降低， Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達均明顯增加，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.05;兩組在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表達無顯性差異，無統(tǒng)計學意義，P>0.05。此結(jié)果能夠與上述機理對應，說明APS可對K562細胞凋亡產(chǎn)生重要影響。

綜上所述，APS對人紅白血病K562細胞進行誘導凋亡可能是通過對Smac、Bax上調(diào)以及對IAP-1、Bcl-2下調(diào)來實現(xiàn)的。

參考文獻

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作者簡介

趙淑敏（1990-），女 ，山東省菏澤市人。住院醫(yī)師。研究方向為血液內(nèi)科。