仿生可降解PCL-PLGA纖維支架負載人臍帶間充質干細胞構建組織工程纖維環

夏金健，徐寶山，馬信龍，張楊，郭悅，楊陽，張維昊，杜立龍，邵鵬飛，何冠宇

腰痛是全球范圍的常見疾病，癥狀重者可導致活動受限甚至殘疾，引起巨額的醫療花費和嚴重的社會負擔[1]。椎間盤退變導致的纖維環破裂和髓核突出是引起腰痛的主要原因。癥狀重者往往需要手術治療，雖可改善癥狀，但存在手術并發癥且術后長期效果不佳[2]。其主要原因是破裂缺損的纖維環會引起椎間盤退變加速，甚至復發[3]。因此修復破裂缺損的纖維環至關重要。

組織工程技術為纖維環的再生修復提供了重要方法。理想的組織工程纖維環支架需具有良好的生物相容性、可降解性和力學性能，并且模擬天然纖維環的微觀結構[4]。為此，本研究采用熔融紡絲技術，以聚己內酯（PCL）和聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）混合物作為原料，旨在構建一種具有生物相容性、適宜降解且具有良好力學性能的組織工程支架，并探討其作為組織工程纖維環的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）組織來源。經在天津醫院婦產科行剖宮產手術的產婦同意，獲取新鮮無污染的人臍帶，用于原代臍帶沃頓膠間充質干細胞（HWJ-MSCs）的取材。（2）主要試劑、儀器。PCL（Sigma，美國）；PLGA（濟南岱罡生物有限公司，質量比PLLA∶PGA=50∶50）；FBS、高糖DMEM 培養液（GIBCO，美國）；二甲基甲酰胺（化學純，天津康科德科技有限公司）；4%多聚甲醛固定液（化學純，上海嘉辰化工有限公司）；Live/dead 染色試劑（Abcam，英國）；CCK-8 細胞檢測試劑盒（DOJIND0，日本）；恒溫培養箱（Hera-cell，德國）；數顯電動攪拌器（上海精學科學儀器有限公司）；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司）；電加熱熔融紡絲機（南開大學分子生物研究所，天津）；Leica 體式顯微鏡（Leica 公司，德國）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi，日本）；力學加載裝置（天津理工大學機械工程學院，天津）；共聚焦熒光顯微鏡（Olympus，日本）；酶標儀（PerkinElmer，美國）。

1.2 混合材料制備 本實驗以比例為65∶35 的PCL-PLGA混合材料支架為實驗組；以純PCL 支架作為對照組。將2種材料經恒溫加熱并攪拌，隨后將混合充分的材料收集備用，見圖1。

1.3 支架制備 制作支架參考Kelnar的方法[5]，使用電加熱熔融紡絲機制備纖維支架管，制作參數及過程見圖2。最終得到直徑5 mm的紡絲管膜。將成品支架稱質量記為Wa，然后浸泡在二甲基甲酰胺溶液中使PLGA 充分溶解后，清洗干燥至恒重時再次稱質量，記為Wb，得出各組支架的實際PCL組成比例，即為Wa/Wb×100%，每組選取5個支架分別重復測量5次取均值。

1.4 支架基本性能評估

1.4.1 孔徑、纖維直徑、孔隙率 截取5 mm 長的成品支架，經體式顯微鏡拍照記錄后固定在樣品臺上，經噴金后放入掃描電鏡下拍照觀察。每組支架選取5張電鏡照片，每張照片隨機選取不同的3 個位置測量支架直徑纖維（μm）、孔徑（μm）。參考Hoyer等[6]的方法，將樣品置入盛有乙醇的量筒中，根據置入前后乙醇體積變化經計算測得支架孔隙率。每組支架重復測量5次取均值。

1.4.2 力學性能檢測 測定過橫截圓環面積的支架兩端固定在力學加載裝置中，分別反復壓縮（V1=1 mm/min）或拉伸（V2=10 mm/min），獲得壓縮或拉伸“力-形變量”的曲線，根據支架形變量和受力面積計算出壓縮彈性模量與拉伸彈性模量。每組支架重復測量5次取平均值。

Fig.1 Preparation process of mixed materials圖1 混合材料制備流程

Fig.2 Melt spinning and parameters圖2 熔融紡絲過程及參數

1.4.3 體外降解 每組（n=25）支架分別稱質量，記為W1。參考 Pan 等[7]的方法，將每個樣本分別置于一個 15 mL 無菌無酶離心管內，每個離心管加入10 mL 1×PBS（pH=7.4），并加入疊氮化鈉（W/W=0.1%）、盤尼西林（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL），37 ℃恒溫震蕩。每組分別從第4 周開始每隔4周取出5 個支架，經沖洗后烘干至恒重后稱質量，記為W2。計算體外質量剩余率 A=（W1-W2）/W1×100%，并取平均值。隨后在體式顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察其結構變化。

1.5 細胞實驗

1.5.1 分離培養人臍帶沃頓膠間充質干細胞 參考Balasubramanian 等[8]的方法提取 HWJ-MSCs。大致步驟如下：將臍帶去掉臍動脈、臍靜脈和臍帶外膜，只留下臍帶沃頓膠。將沃頓膠剪成2 mm3小塊放入小瓶中，加入0.2%Ⅰ型膠原酶并加入Hanks溶液稀釋混勻。4 ℃消化過夜后將裝有沃頓膠和消化液的小瓶放置于37 ℃搖床200 r/min 震蕩2 h 充分消化。將溶液通過200目無菌鋼網過濾后放入無菌離心管中，1 300 r/min 離心7 min。離心后棄一半上清液，再次加入Hanks 溶液1 300 r/min 離心7 min，得到的沉淀即為原代細胞。將細胞移入T25培養瓶中并加入含1%青霉素和鏈霉素及20%FBS 的高糖DMEM 培養液，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中孵育，隔天換液。待細胞生長融合80%～90%密度時進行傳代，P3代細胞被用于本實驗研究。

1.5.2 組織工程纖維環體外構建 將支架切成2 mm厚的圓環薄片，滅菌后在孔板中經含血清培養液浸泡過夜后，吸干培養液，將消化好的 P3 代 HWJ-MSCs 以 2×106/mL 的密度接種在支架上。孵育2 h后，向每個孔中加入200 μL培養液，再次放入37 ℃恒溫培養箱中孵育，隔天換液。

1.5.3 材料細胞生物相容性檢測 分別在負載細胞后的第1、5天取出細胞支架復合體，經無菌PBS清洗和4%多聚甲醛固定30 min后加入細胞Live/dead染色工作液，37 ℃恒溫培養箱避光孵育20 min，然后再用無菌PBS清洗。隨后將支架取出放置于共聚焦皿中，使用共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞存活情況。

1.5.4 材料毒性檢測 細胞支架復合體培養1、3、5、7 d時分別加入20 μL CCK-8工作液，隨后置于37 ℃恒溫箱孵育3 h。最后避光使用酶標儀檢測4 個時間點樣品在450 nm 波長處的光密度（OD）值。

1.6 統計學方法 本實驗數據均使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量數據分析結果均以均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗比較實驗組和對照組之間的差異性，采用單因素方差分析比較組內不同時間點差異性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 支架形態結構及性能特征

2.1.1 支架材料比例驗證 經檢測，實驗組支架PCL 的質量占比均與制料時一致。PLGA 溶解后的實驗組支架在體視顯微鏡下仍表現出規則的纖維走向及規則的孔隙形狀，可見PCL 和PLGA 兩種材料混合充分，且幾乎沒有任何材料損失，而對照組支架PLGA 溶解前后在大體觀察及體式顯微鏡下觀察時未見明顯差異，見圖3A、B。

Fig.3 Pictures before and after SDS immersion of each group of scaffolds圖3 各組支架PLGA溶解前后圖片

2.1.2 支架觀察 大體下可見2組環形熔融紡絲支架整體形狀規則，由PCL纖維均勻環繞而成；體視顯微鏡鏡下可見2組支架各層纖維呈平行斜交的規則走向，見圖3A。掃描電鏡圖片可見絲與絲交錯形成大量菱形孔隙，各孔隙成角接近60°，且各孔空間疊加較緊密，見圖4。實驗組和對照組支架的纖維直徑（μm：50.914±1.367vs.49.674±1.193，n=5，t=1.528，P=0.165）、孔徑（μm：70.288±1.157vs.71.524±1.128，n=5，t=1.710，P=0.126）、孔隙率（72.344%±0.805%vs.73.148%±0.766%，n=5，t=1.618，P=0.144）差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.1.3 力學性能測試 實驗組支架的壓縮彈性模量（MPa：1.415±0.110vs.2.365±0.193，n=5，t=9.825，P＜0.001）和拉伸彈性模量（MPa：5.467±0.231vs.8.956±0.220，n=5，t=24.470，P＜0.001）均較對照組下降，見圖5。

Fig.4 SEM figure of scaffolds(×1 000)圖4 支架掃描電鏡圖（×1 000）

Fig.5 Comparison of mechanical parameters between the two groups圖5 2組支架的力學參數比較

2.1.4 體外降解結果 體視顯微鏡照片顯示，實驗組支架在體外模擬環境中出現了纖維折斷、粉碎的情況，表現出降解趨勢，20周時混合支架破碎，完整性被破壞，見圖6A～C；通過SEM 可以更直觀地觀察到，4 周時實驗組支架纖維橫截面表現出一定程度的裂縫，見圖6G。而且隨著時間的延長，在第12 周時實驗組纖維可見許多更細小的纖維從中剝離的趨勢，見圖6H；第20 周時出現了支架碎裂，完整性缺失的情況，見圖6I。而對照組PCL 支架纖維在3 個時間點的SEM中未觀察到明顯變化，見圖6J～L。實驗組質量剩余率隨著時間的延長而降低，在各個時間點差異有統計學意義（P＜0.01）。對照組各個時間點的稱質量結果之間差異無統計學意義（P＞0.05）。在每個時間點上，實驗組和對照組質量剩余率差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

Fig.6 Microscopy and SEM images of the degradation process of the two groups of scaffolds in vitro圖6 2組支架體外降解過程的體式及SEM圖片

2.2 支架干細胞復合體構建

2.2.1 干細胞提取擴增 提取干細胞經傳代培養后，生長狀態表現為典型的干細胞的長梭條狀，細胞近核部較為飽滿，頭端和尾端較細長。顯微鏡下P3代人臍帶間充質干細胞傳代后第3 天的狀態，可清楚地觀察到干細胞形態，見圖7。

Fig.7 The morphology of the extracted stem cells under a microscope（×200）圖7 提取干細胞顯微鏡下形態觀察（×200）

2.2.2 Live/dead 染色 支架接種細胞后，每天可觀察到培養液pH 值變化明顯。細胞Live/dead 染色的結果顯示，各組支架上細胞存活（綠色熒光）良好，第1天2組支架均有少量活細胞存在于觀察視野中，見圖8A、C。但第5 天可觀察到實驗組支架上活細胞數量明顯較對照組支架多，見圖8B、D。上述2個時間點各組支架均未觀察到死細胞（紅色熒光）。

Fig.8 Live/dead staining of scaffold-loaded cells(×200)圖8 各組支架負載細胞的Live/dead染色（×200）

2.2.3 支架細胞毒性檢測 結果顯示，各組OD值均有隨時間的延長而增加的趨勢，但實驗組總體漲幅明顯高于對照組，培養的第1天，各組支架的培養液OD值差異無統計學意義（P＞0.05）；從第3天開始實驗組高于對照組，且隨著時間的延長，2組間差異逐漸增加，第 7 天時 2 組間差異明顯（P＜0.01）。見表2。

3 討論

3.1 纖維環組織工程支架的仿生結構 近年來，纖維環組織工程成為纖維環修復領域的研究熱點。目前國內外專家研究的生物支架制備技術種類很多，包括靜電紡絲、冷凍干燥技術、濕紡、3D 打印等技術。Nerurkar等[9]曾利用靜電紡絲制作出斜向60°交叉層疊的PCL纖維膜支架來模仿纖維環結構；Alvim Valente 等[10]曾使用冷凍干燥技術制作了 PCL 和PLGA的混合支架；本課題組采用濕法紡絲技術模擬天然纖維環結構，制備出PCL 三維圓周取向的微米纖維支架[11]；也有研究者以絲素蛋白為原料，采用定向結晶技術構建出微孔結構支架[12]。但通過這些方法得到的支架取向性較差，達不到人體纖維環60°規則排列的結構模式，而且孔徑規格大小并不統一，不利于細胞貼壁生長。熔融紡絲又稱熔體紡絲，是一種以聚合物為原料，通過將原料加熱并從噴絲孔中擠出，經空氣冷卻固定成粗細均勻的纖維絲的技術。Brown 等[13]應用熔融紡絲的方法成功制作出纖維成角、孔徑和空隙率均一的PCL 管狀支架。本實驗以熔融紡絲為方法構建出的纖維環組織工程支架，其取向性模擬了人體纖維環60°成角的特征。電鏡下可見支架纖維表面光滑且排列規則，因而孔隙的形狀及分布高度規則；經檢測其較大的孔隙率、孔徑和規則的孔隙也將為細胞吸附和增殖提供適宜的場地條件。

Tab.1 Comparison of the remaining ratios of degradation at different time points between two groups表1 各時間點實驗組和對照組體外降解質量剩余率比較 （n=5，%，±s）

Tab.1 Comparison of the remaining ratios of degradation at different time points between two groups表1 各時間點實驗組和對照組體外降解質量剩余率比較 （n=5，%，±s）

＊＊P＜0.01

時間對照組實驗組t 4周99.11±0.57 94.15±0.83 11.710＊＊8周98.96±0.55 82.56±0.55 38.113＊＊10周98.80±0.64 78.41±0.88 46.118＊＊12周98.90±0.47 62.90±0.84 86.332＊＊16周98.70±0.55 49.17±0.54 20 125.486＊＊F 0.399 2 811.616＊＊

Tab.2 CCK-8 assay for cell proliferation in experimental and control groups at various time points表2 CCK-8法檢測實驗組和對照組各時間點細胞增殖情況 （n=5，OD值，±s）

Tab.2 CCK-8 assay for cell proliferation in experimental and control groups at various time points表2 CCK-8法檢測實驗組和對照組各時間點細胞增殖情況 （n=5，OD值，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組實驗組t第1天0.24±0.01 0.25±0.01 1.472第3天0.37±0.03 0.45±0.04 3.616＊第5天0.56±0.07 0.88±0.04 7.135＊＊第7天1.08±0.11 1.60±0.05 8.905＊＊F 117.084＊＊1 002.127＊＊

3.2 纖維環組織工程支架的生物降解性和力學性能 PLGA 和PCL 作為經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準可用于臨床的高分子材料，其安全性是毋庸置疑的。PCL 擁有良好的力學性能，但降解周期較長；PLGA 具有較好的降解活性，但因其質地較脆而導致力學性能差強人意[14]。Kelnar 等[5]將PCL與PLGA 混合在一起，結果表明材料混合可以有效控制降解速度，同時混合材料的生物相容性較純PLGA 并沒有明顯下降。本研究降解實驗顯示在PCL 中摻入PLGA 后，其降解性有明顯改善，同時力學結果顯示實驗組的彈性模量雖然較對照組有所下降，但仍在人體正常纖維環力學強度范圍內。有動物實驗證明破裂纖維環經修復后6個月時椎間盤的生物力學強度可恢復到正常水平的52.30%，術后12個月的生物力學強度恢復率可達91.79%[15]。本實驗結果顯示，實驗組支架第3 個月時的體外質量剩余率接近50%，其降解速率與已知的椎間盤自我修復過程基本相適應。在降解檢測過程中，實驗組支架在20周時出現支架纖維破碎、結構完整性丟失的情況。我們考慮這一方面是由于體外降解過程一直在震蕩條件下完成的，因而支架會受到外界額外的力學影響；另一方面，我們只模擬了體內的液體環境而忽略了體內的生物因素，當支架植入體內后，體內組織細胞填充到支架孔隙中，產生額外的支撐作用。

3.3 纖維環組織工程支架對種子細胞生物相容性的影響 Cui等[16]通過細胞Live/dead染色和MTT檢測驗證了PLGA 對細胞的生物相容性優于PCL。Ouyang 等[17]經體外實驗證實了骨髓間充質干細胞（BMSCs）在PLGA 材料上的增殖能力遠高于PCL。本研究通過細胞Live/dead 染色和CCK-8 細胞毒性檢測結果證實人臍帶間充質干細胞在混合支架上的5 d增殖速率明顯快于PCL組。

綜上所述，本研究首次以PCL-PLGA 混合材料為原料，通過熔融紡絲技術構建出既具有生物相容性、同時也具備適宜降解性以及良好力學性能的仿生纖維環組織工程支架。通過多種技術手段檢測，我們認為PCL-PLGA 混合支架在力學強度、降解速率以及干細胞相容性等方面都有著優異的表現。本實驗所有的檢測均是基于環狀外形的組織工程支架的基礎上而實現的，接下來我們將進行體內實驗和動物實驗，并嘗試截取部分圓環支架在小動物纖維環缺損模型上進行體內修復，以便進一步驗證此種支架的修復潛力。但本研究仍有不足之處：首先，本實驗選取的PLGA其構成比為50∶50，雖然此比例的PLGA具有良好的生物相容性，同時可以借助PCL提高其力學性能，但也應考察其他構成比的PLGA 與PCL結合后的性能。其次，PLGA材料在降解過程中會釋放酸性物質的問題仍有待解決。