硫酸右旋糖苷對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王文莙，曹相玫，馬艷梅，楊媛媛，徐遠(yuǎn)義△，黃允寧

胃癌已成為癌癥死亡的第三大病因，其5年生存率低于25%[1-2]。目前，臨床上治療胃癌以外科手術(shù)為主，但部分胃癌患者發(fā)現(xiàn)已是晚期，錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，尋找低毒、高效的治療胃癌的藥物具有重要意義。研究表明硫酸右旋糖苷（DS）作為低毒藥物能抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[3]。本課題組前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，DS 能減少胃癌血管生成，減少裸鼠胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量和體積[4]。但DS 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究旨在觀察DS對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響，從而為研發(fā)胃癌新的治療策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株（MGC-803）購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清購(gòu)自Fumeng Gene公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素/鏈霉素均購(gòu)自北京Solarbio 公司。DS 購(gòu)自Sigma公司，將DS溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）用于細(xì)胞培養(yǎng)，用22 μm 的過濾器進(jìn)行無菌過濾，最終使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。總蛋白提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、EdU 試劑盒均購(gòu)自凱基生物公司。AnnexinV-PI 凋亡試劑盒購(gòu)自貝博公司；Zeste 增強(qiáng)子同源物2（enhancer zeste of homolog 2，EZH2）單克隆抗體（兔抗人）和Cleaved-caspase3 單克隆抗體（兔抗人）均購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司。β-Tublin單克隆抗體（鼠抗人）購(gòu)自康為世紀(jì)公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體和山羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus 公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Formal Scientific 公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，待細(xì)胞接近融合時(shí)用0.25%胰酶消化傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并計(jì)數(shù)，傳于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，于對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別加入等體積PBS和DS（終濃度0.3%）放置于常氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2、8、12、24 h收集細(xì)胞備檢；24孔板進(jìn)行爬片，藥物濃度同上。

1.2.2 EdU實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MGC-803細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為8×105個(gè)/mL，以400 μL/孔接種于24 孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞爬片。貼壁后實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行DS干預(yù)，對(duì)照組加入等體積的PBS。干預(yù)24 h 后按照EdU 試劑盒說明書進(jìn)行操作，EdU 溶液孵育2 h 后用4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100 作為促滲劑，Click-It 反應(yīng)物進(jìn)行染色，用Hoechst 進(jìn)行DNA 復(fù)染；采用熒光顯微鏡避光采圖。藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞總數(shù)，紅色熒光標(biāo)記增殖的細(xì)胞，細(xì)胞增殖率=紅色熒光細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MGC-803細(xì)胞，按每個(gè)培養(yǎng)皿800 個(gè)細(xì)胞接種于含培養(yǎng)基的60 mm 皿中，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，過夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行DS 干預(yù)，對(duì)照組加入等量的PBS。干預(yù)24 h 后更換為完全培養(yǎng)基，每3～4 d 更換培養(yǎng)基，培育12 d。PBS 沖洗，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色、拍照后使用Image-Pro Plus計(jì)算每個(gè)皿中細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌MGC-803細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待過夜貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含0.3%DS的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含有等體積PBS的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，用冷的PBS 洗3 遍，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，其余步驟按照AnnexinV-PI凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白免疫印跡 將人胃癌MGC-803 細(xì)胞接種到60 mm 的培養(yǎng)皿中，過夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入含有藥物濃度為0.3%DS的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含有等量PBS的培養(yǎng)基，收集干預(yù)不同的時(shí)間點(diǎn)（2、8、12、24 h）的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白含量。蛋白免疫印跡（Western blot）中各組上樣60 μg（20 μL）蛋白進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳，80 V（20 min），120 V（40 min）恒壓濕轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后用10%脫脂牛奶封閉，兔抗人 EZH2（1∶1 000）、兔抗人 Cleavedcaspase3（1∶1 000）和鼠抗人β-Tublin（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜，TBST震蕩洗滌3次，以TBST稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 震蕩洗滌3次后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光采圖，用Photoshop CC 2017軟件進(jìn)行灰度值分析，用目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值進(jìn)行蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用 EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1、表1。

Fig.1 The effect of DS on the proliferation of MGC-803 cells(scale bar=100 μm)圖1 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響（比例尺為100 μm）

2.2 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞集落形成的抑制作用 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組新克隆形成數(shù)量明顯減少（P＜0.01），克隆球形成較小且染色較淺，見圖2、表1。

2.3 DS對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），見圖3、表1。

2.4 DS 對(duì) EZH2、Cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組EZH2蛋白水平在2 h無明顯變化，8、12、24 h明顯降低（P＜0.05）；Cleaved-caspase3蛋白水平在2、8、12、24 h較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），見圖4、表2。

Tab.1 The effects of DS on proliferation,colony formation and apoptosis of MGC-803 cells表1 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖、克隆形成及凋亡的影響（n=3，±s）

Tab.1 The effects of DS on proliferation,colony formation and apoptosis of MGC-803 cells表1 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖、克隆形成及凋亡的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t細(xì)胞增殖率（%）76.00±3.61 20.33±4.51 16.700＊＊克隆形成（個(gè)/視野）1 189.67±146.74 238.67±35.50 10.910＊＊凋亡率（%）3.5±0.5 14.5±0.5 26.944＊＊

Fig.2 The effect of DS on colony forming ability of MGC-803 cells圖2 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞集落形成能力的影響

Fig.3 The effect of DS on cell apoptosis of MGC-803 cells圖3 DS對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的三大癌癥死亡原因之一[5]，如今，胃癌在亞洲具有較高的發(fā)病率和死亡率[6]，由于大多數(shù)胃癌在明確診斷時(shí)已發(fā)展至中晚期，因此，化療成為胃癌治療的方法之一[7]。因傳統(tǒng)的化療藥物易耐藥且不良反應(yīng)大，因此，尋找低毒、高效、不良反應(yīng)小的藥物具有重大意義。

Fig.4 The protein expression levels of EZH2 and Cleaved-caspase3 detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)EZH2、cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)

Tab.2 The protein expression levels of EZH2 and Cleaved-caspase3 detected by Western blot assay表2 Western blot檢測(cè)EZH2、Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá) （n=3，±s）

Tab.2 The protein expression levels of EZH2 and Cleaved-caspase3 detected by Western blot assay表2 Western blot檢測(cè)EZH2、Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá) （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t EZH2蛋白相對(duì)表達(dá)量2 h 0.82±0.08 0.72±0.17 0.983 8 h 1.05±0.15 0.72±0.10 3.143＊12 h 1.07±0.11 0.52±0.12 5.910＊＊24 h 0.95±0.18 0.35±0.27 3.581＊組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t Cleaved-caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量2 h 0.31±0.06 0.58±0.12 3.584＊8 h 0.53±0.05 0.76±0.01 7.271＊12 h 0.38±0.01 0.92±0.01 77.534＊＊24 h 0.46±0.01 0.97±0.02 36.524＊＊

本課題組采用的抗癌藥物DS 屬于大分子硫酸右旋糖苷衍生物，相對(duì)分子質(zhì)量為5×105，具有安全性高、不良反應(yīng)小、腹腔吸收慢等優(yōu)點(diǎn)[8]。本課題組前期體內(nèi)外研究表明，DS 有抑制胃癌細(xì)胞血管生成，抑制裸鼠胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)DS 與LOX 抑制劑β-氨基丙腈（BAPN）聯(lián)合應(yīng)用后抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的效果較單獨(dú)使用DS 或BAPN 更明顯，本研究在前期課題組研究的基礎(chǔ)上選取最佳藥物濃度0.3%DS作為干預(yù)劑量[9]，結(jié)果表明DS 能明顯抑制MGC-803 細(xì)胞的增殖，減弱細(xì)胞集落形成能力并誘導(dǎo)MGC-803 細(xì)胞凋亡。表觀遺傳在腫瘤的進(jìn)展當(dāng)中發(fā)揮重要作用，表觀遺傳學(xué)調(diào)控失調(diào)是惡性腫瘤的一大特點(diǎn)，包括DNA和組蛋白的甲基化[10]。表觀遺傳調(diào)控因子EZH2 是PRC2（polycomb repressor complex 2）基因沉默復(fù)合物的核心成員，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可催化組蛋白H3K27三甲基化和異染色質(zhì)形成從而介導(dǎo)抑癌基因表達(dá)沉默[11]。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2 在膀胱癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、卵巢癌[14-15]、肺癌等[16]實(shí)體腫瘤中高表達(dá)并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。EZH2 通過調(diào)控增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤的生長(zhǎng)；在膠質(zhì)瘤中，下調(diào)EZH2 可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[17-18]，除此之外EZH2 還參與凋亡的相關(guān)調(diào)控，下調(diào)EZH2 可以激活凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，敲減EZH2可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中caspase3的活性升高，細(xì)胞凋亡率明顯增高[20]。Cleaved-caspase3是細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Caspases3的激活體，在細(xì)胞凋亡中起著決定性的作用[21]。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，各個(gè)凋亡信號(hào)通路最終激活Caspase3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，DS 可以抑制EZH2，促進(jìn)Cleavedcaspase3的表達(dá)，發(fā)揮促凋亡作用。

綜上所述，DS 可以體外抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與抑制EZH2表達(dá)有關(guān)，為臨床藥物治療胃癌提供了新的思路。但DS如何抑制EZH2的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用還需進(jìn)一步研究。