冠狀動脈支架內再狹窄與炎癥標志物及組織因子的關系

馬偉濤，夏大勝，夏偉，王麗，盧成志，何強

支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR）是經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）術后困擾臨床的一大難題。盡管已經證實使用藥物洗脫支架（drug-eluting stents，DESs）可以抑制內膜增生，降低 ISR 發生率[1]。但DESs 可影響內皮化再生，ISR 的發生率仍高達10%左右[2]。炎癥參與動脈粥樣硬化的發生與發展，并影響其預后。激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是一種核轉錄因子，通過影響細胞因子及其他炎癥介質的作用，參與動脈粥樣硬化的發生與發展[3]。磷酸化c-jun是其主要活化形式，其數量可反映體內AP-1水平[4]。CD40配體（CD40 ligand，CD40L）在血小板及單核細胞表面表達，促進血小板的黏附及血栓的形成[5]。AP-1 及 CD40L 是體內重要的炎癥標志物。組織因子（tissue factor，TF）作為聯系炎癥與凝血途徑之間的橋梁，參與動脈粥樣硬化的發生及發展[6]。組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是 TF 的內源性抑制因子，可特異性地抑制TF介導的血栓形成過程及炎癥過程，參與動脈粥樣硬化過程。越來越多的證據表明，低度慢性炎癥是ISR發病機制中的關鍵環節[7]。目前有關TF與冠狀動脈ISR相關性的研究尚少見。本研究旨在分析PCI術后ISR與炎癥標志物c-jun、CD40L及TF、TFPI的關系，并探討發生ISR的可能影響因素。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年12月—2017年6月因冠心病就診于天津市第一中心醫院并行PCI的患者200例，其中男161例，女39例，年齡43～78歲，平均（57.12±6.83）歲。經臨床癥狀及冠脈造影明確冠心病診斷，并符合中華醫學會2007年冠心病診斷標準并行PCI術。所有研究對象在完全了解本研究并簽署知情同意書后方可入組。排除標準：嚴重感染性疾病、重度心力衰竭、惡性腫瘤、慢性肝腎功能不全、結締組織疾病。

1.2 一般臨床資料收集 收集所有研究對象的一般臨床資料，包括性別、年齡、身高、體質量、吸煙史、高血壓、糖尿病病史。所有患者均隔夜禁食12 h，于次日清晨7：00采集空腹肘正中靜脈血5 mL，以3 000 r/min 離心15 min 后分離血清，置于-80 ℃冰箱中待檢。采用德國COBAS MODULAR DPP 全自動生化分析儀測定患者總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）水平。

1.3 PCI的實施 由臨床經驗豐富的心內科介入醫師操作，采用標準Judkin’s 法經橈動脈或股動脈入路行冠脈造影+PCI 術。記錄所用支架的直徑及長度。根據改良的Gensini積分評分標準，對每支冠脈血管的病變狹窄程度進行計量評估。Gensini積分計算方法：將冠狀動脈分成14段，當冠狀動脈狹窄0～25%時權重系數為1，冠狀動脈狹窄26%～49%時為2，狹窄50%～74%時為4，狹窄75%～89%時為8，狹窄90%～99%時為16，狹窄100%時為32；根據冠狀動脈病變的不同節段確定權重系數，左主干病變為5，前降支近段、回旋支近段為2.5，前降支中段為1.5，右冠狀動脈、前降支遠段、回旋支遠段、左心室后側支、鈍緣支動脈、第1對角支、心尖支為1.0，第2 對角支為0.5。總分為冠狀動脈管腔狹窄程度權重系數乘以各病變血管的權重系數之和。

1.4 冠脈ISR的判斷與檢測 PCI術后規律服用雙聯抗血小板聚集、調脂等藥物治療。術后1年復查冠脈造影。判斷是否發生ISR，并根據判定結果分為ISR組與對照組。冠脈ISR定義：應用冠脈定量測定法測定，支架遠端與近端、支架內距支架邊緣≤5 mm，支架植入段狹窄程度≥50%。

1.5 磷酸化c-jun、TF、TFPI 指標檢測 所有患者于復查冠脈造影時采集空腹肘正中靜脈血5 mL，以3 000 r/min 離心15 min 后分離血清，置于-80 ℃冰箱中待檢。采用酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測外周血白細胞裂解液中磷酸化c-jun 吸光度（A）值及TF、TFPI 水平，磷酸化c-jun 試劑盒購自美國CST 公司、TF、TFPI試劑盒購自美國ADI公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 血小板表面CD40L測定 所有患者于復查冠脈造影時采集肘正中靜脈血2 mL，加入含1%的EDTA抗凝試管中，全血檢測血小板CD40L。流式抗體FTIC Mouse IgGκ 及FTIC anti-human CD40L 購自美國BD PharMingen 公司，按說明書要求進行操作。取2 支FALCON 管，分別標記（+）和（-），兩管均加入標本（E-DTA-K2抗凝靜脈血）5 μL。向（-）管中加入FTIC Mouse IgGκ 20 μL，向（+）管中加入FTIC anti-human CD40L 20 μL混勻。室溫避光靜置30 min。每管加入生理鹽水2 mL，混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清。再向每管加入生理鹽水1 mL，混勻，通過流式細胞儀統計血小板膜CD40L平均熒光強度。

1.7 統計學方法 采用SPSS 16.0 軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用非參數秩和檢驗。計數資料以例（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料相關性分析采用Pearson 相關；不符合正態分布的計量資料相關性分析采用Spearman相關。ISR的影響因素采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組一般資料比較 PCI 術后1年復查冠脈造影，ISR 組 27 例，對照組 173 例。ISR 組吸煙、糖尿病、Gensini 積分、支架長度、TC 及 LDL-C 水平均高于對照組（P＜0.05）。2組間年齡、性別、體質量指數（BMI）、高血壓、支架直徑、TG及HDL-C比較差異均無統計學意義，見表1。

2.2 2 組患者磷酸化 c-jun、CD40L、TF、TFPI 及 TF/TFPI 水平的比較 ISR 組磷酸化c-jun、血小板CD40L熒光強度、TF、TFPI及TF/TFPI水平均高于對照組（P＜0.01），見表2。

2.3 ISR 組患者磷酸化 c-jun 與 CD40L、TF 及 TFPI相關性分析 磷酸化c-jun 水平與血小板CD40L 熒光強度、TF及TFPI均呈正相關（rs分別為0.766、0.496、0.540，P＜0.05）。血小板CD40L 熒光強度與TF及TFPI均呈正相關（r分別為0.652、0.702，P＜0.05）。

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups表1 2組間一般臨床資料的比較

Tab.2 Comparison of the levels of phosphorylated c-Jun，CD40L，TF，TFPI and TF/TFPI between two groups表2 2組患者磷酸化c-jun、CD40L、TF、TFPI及TF/TFPI水平的比較

2.4 ISR 發生的多因素Logistic 回歸分析結果 以是否出現ISR（是=1，否=0）為因變量，以年齡、性別（男=1，女=0）、吸煙史（有=1，無=0）、糖尿病史（有=1，無=0）、高血壓病史（有=1，無=0）、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C、支架長度、支架直徑、磷酸化c-jun、血小板CD40L熒光強度、TF、TFPI及TF/TFPI水平為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，糖尿病、高TC、高血小板CD40L 熒光強度、高TF/TFPI及植入支架長度較長是發生ISR 的危險因素（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Multivariate Logistic regression analysis of ISR表3 ISR發生的多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

ISR是影響PCI遠期預后的重要因素，其病理生理過程復雜，主要包括受損血管重構、炎癥反應和平滑肌細胞增殖遷移3個階段。血管內皮損傷及炎癥反應是ISR 的起始環節，血管平滑肌細胞增殖與遷移、血管新生內膜過度增厚是ISR的中心環節[8]。炎癥反應被認為是ISR 的重要機制之一。PCI 術后局部內皮損傷會激活炎癥反應，介導血栓形成，造成ISR，同時促進血管平滑肌細胞增殖，加重ISR[9]。目前有關ISR與炎癥標志物AP-1、CD40L及TF關系的研究較少。

既往研究表明，AP-1影響絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促進平滑肌細胞增殖，促進炎癥因子及內皮素-1的釋放，在ISR中起重要作用[10]。AP-1可促進其下游通路基質金屬蛋白酶- 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達，而其內源性抑制劑組織金屬蛋白酶抑制物-2表達雖代償性增加，但增加幅度有限，不足以抵消MMP-2 的作用。MMP-2 調節基質降解和平滑肌細胞遷移，從而在ISR 中發揮作用[11]。Buchwald 等[12]研究顯示，應用抗AP-1 誘餌寡脫氧核苷酸治療能顯著減小高膽固醇血癥小型豬冠狀動脈中的新生內膜厚度，提示抗AP-1 結合位點的誘餌寡核苷酸能有效抑制內膜再生，減少ISR 發生率。本研究結果顯示，ISR 組血清磷酸化c-jun 水平較對照組升高，而Logistic 回歸分析未提示磷酸化c-jun是ISR的影響因素，推測可能與樣本量較少或CD40L、TF、TFPI 的相互影響有關，在后續研究中應擴大樣本量，并減少各因素的相互影響程度。

CD40L 是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，具有趨化因子的活性。CD40L系統廣泛分布于血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞及血小板表面。CD40L 與CD40 結合后通過誘導內皮細胞內細胞黏附分子和TF 參與炎癥、血栓形成和動脈粥樣硬化，在動脈粥樣硬化病變進展和炎癥過程中起著重要作用[13]。有研究表明CD40/CD40L 通過誘導細胞因子、趨化因子、生長因子等的表達來使動脈粥樣硬化斑塊不穩定，并參與多種炎癥反應病理生理過程，從而導致ISR 的發生[14]。Yan 等[15]通過間接免疫熒光流式細胞術分析120例PCI患者和20例正常對照者的血小板CD40L水平，PCI術后隨訪6個月，觀察ISR的發生情況。結果顯示，發生ISR 者的血小板CD40L 水平明顯升高。本研究結果顯示，ISR 組CD40L 水平較對照組明顯升高，且高CD40L 水平是發生ISR的危險因素，與以往研究結果一致。

TF又稱凝血因子Ⅲ，與Ⅶa結合，為外源性凝血途徑啟動的關鍵因子。TF/Ⅶa促進單核細胞向巨噬細胞轉化，誘導炎癥反應，同時通過調控細胞信號轉導，促進成纖維細胞、單核細胞的增殖和遷移，參與動脈粥樣硬化發生發展[16]。而TFPI 通過與TF-Ⅶa復合物結合，抑制凝血過程。一項旨在探討TFPI涂層支架在抑制兔頸動脈模型再狹窄中有效性和安全性的研究表明，TFPI包被的支架可以成功地將TFPI基因轉染到血管壁細胞中，從而在兔頸動脈模型中抑制再狹窄且未發生明顯的不良反應[17]。本研究結果顯示，ISR 組 TF、TFPI 及 TF/TFPI 水平較對照組明顯升高，提示ISR 患者TF 水平升高，TFPI 水平雖有代償性升高，但不足以抵消TF 作用。另外，高TF/TFPI 水平是發生ISR 的危險因素。與以往研究相比，明確了TF/TFPI在ISR發生中的作用。本研究中磷酸化c-jun 水平與血小板CD40L 熒光強度、TF 及TFPI 均呈正相關，血小板CD40L 熒光強度與TF 及TFPI呈正相關。有研究表明CD40/CD40L可通過激活體內二酰基甘油—蛋白激酶C信號通路上調炎癥因子表達，促進內皮細胞及單核細胞TF 的表達[18]。而CD40L誘導人內皮細胞中TF的表達是通過AP-1介導的[19]。因此，筆者推測 CD40L 是通過 AP-1 介導促進內皮細胞TF表達，參與ISR過程。

綜上所述，炎癥標志物磷酸化c-jun、CD40L 及TF促進冠心病患者PCI術后ISR的發生。