外源性褪黑素對尼古丁處理雄性大鼠生育能力的影響

胡皓睿，楊衛民，黃繪，廖明，周曉明

目前研究認為男性不育與吸煙有顯著關聯[1]。而尼古丁是香煙中毒性最大的化合物，對女性和男性生殖系統均有不良影響[2-3]。多項研究表明，尼古丁可減少睪酮和黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）等釋放[2，4]。尼古丁通過影響正常形態精子的數量、運動和生存，從而降低男性的生育能力[5]。另外，尼古丁攝入量均與生殖系統細胞凋亡增加相關，且沒有性別差異[6]。高抗氧化化合物可有效減少尼古丁作用，褪黑素具有強大的抗氧化活性。男性的褪黑素被睪丸吸收，可調節睪丸活動，也可調節睪丸中細胞生長、有絲分裂和間質細胞的分泌[7]。化療、糖尿病和高脂血癥等因素可影響褪黑素對睪丸的保護作用[8]。目前尼古丁對于男性生殖系統的影響已有較多報道，然而褪黑素對尼古丁處理睪丸的影響尚少見相關報道。本研究旨在評估褪黑素對尼古丁處理大鼠精子發生、精子核完整性和附睪精子參數的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 32 只清潔級雄性SD 大鼠，體質量180～220 g，購自貴州醫科大學動物中心（許可證號：SCXK2013-0001）。正常鼠糧飼養，自由飲水和攝食，且每周更換墊料；每日光照12 h，黑暗12 h。采用隨機數字表法將大鼠分為4組，每組8 只。A 組為對照組，腹腔注射生理鹽水（10 mL/kg）；B 組腹腔注射尼古丁1 mg/kg；C 組腹腔注射褪黑素10 mg/kg；D組腹腔注射尼古丁1 mg/kg+褪黑素10 mg/kg，各組均每日注射1 次，持續30 d。尼古丁在給藥前用生理鹽水稀釋為0.5 g/L。褪黑素使用前先用無水乙醇溶解，然后加生理鹽水稀釋為5 g/L。

1.1.2 實驗儀器和試劑 石蠟切片機（深圳永年科技有限公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；精子質量檢測系統（北京偉力新世紀科技發展公司）；褪黑素（上海梯希愛化成工業發展有限公司）；尼古丁酒石酸鹽、福爾馬林和HE染料（美國Sigma 公司）；低熔點瓊脂糖（上海谷研生物科技有限公司）；DNA 完整性檢測試劑盒（深圳博銳德生物科技有限公司）；TUNEL 染色試劑盒、睪酮和LH 酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 精子發生分析 所有大鼠在31 d通過頸椎脫位處死，切除睪丸和附睪。右側睪丸采用10%福爾馬林固定，脫水及石蠟包埋。然后制備5 μm切片并進行HE染色，在光學顯微鏡下評估精子發生情況。通過Johnsen評分法對精子質量和成熟度進行評估[8]。生精細胞包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子。觀察各組生精小管結構、小管內各級生精細胞數量等變化。連續觀察100個生精小管，計算其平均分，評分標準參照文獻[9]。

1.2.2 TUNEL染色 右側睪丸通過10%福爾馬林固定，脫水及石蠟包埋，制備5 μm 石蠟切片。按照TUNEL 染色試劑盒說明書檢測各組大鼠睪丸上細胞凋亡情況。在光學顯微鏡下，每只小鼠取20個生精小管橫截面進行凋亡細胞計數，取平均數。

1.2.3 ELISA分析 大鼠處死后立即從下腔靜脈采血1 mL。靜置1 h后離心，分離血清，并置于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA 法檢測血清睪酮和LH 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 附睪精子參數 取大鼠附睪尾部置于3 mL 37 ℃生理鹽水中，剪碎并靜置1 min，制成精子混懸液。采用WL-9000型精子質量檢測系統檢測精子的活力及密度等。采用改良巴氏染色法染色，對精子懸液涂片進行形態學分析[10]。

1.2.5 精子染色質擴散實驗 按照精子DNA 完整性檢測試劑盒說明書進行操作。取大鼠附睪尾部置于3 mL 37 ℃生理鹽水中，剪碎并靜置1 min，制成精子混懸液。70 μL 低熔點瓊脂糖融化于65～90 ℃水中，在37 ℃下放置3 min，然后加入30 μL 精子溶液，混合均勻。吸取10 μL 配制好的精液置于0.65%瓊脂澆制載玻片上，蓋上蓋玻片，在4 ℃冰箱中放置4 min。去除蓋玻片，22 ℃下放入0.08 mol/L HCl 內7 min，然后置于變性液（包括2-巰基乙醇、酸性Tris、鈉十二烷基硫酸鹽、乙二胺四乙酸和氯化鈉）中25 min。標本片用蒸餾水沖洗2次。將混勻好的染液滴加到玻片上，染色5 min。在常規顯微鏡400 倍鏡下觀察結果，計數200 個精子，觀察精子光暈，有光暈表示精子DNA完整，根據形態分為大、小光暈；無光暈表示精子DNA 斷裂。DNA 碎片指數=DNA 斷裂精子/全部精子×100%。

1.3 統計學方法 數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行Tukey 檢驗；變量間相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組生精細胞計數和Johnsen 評分比較 （1）生精細胞計數。與A 組比較，B 組生精細胞計數均明顯減少；C 組生精細胞計數與A 組差異無統計學意義；D 組次級精母細胞、精子細胞個數少于A 組，精原細胞、初級精母細胞和精子個數與A 組差異無統計學意義；C 組和D 組生精細胞計數均多于B 組，C 組與D 組生精細胞計數差異無統計學意義。（2）Johnsen 評分。B 組 Johnsen 評分低于 A 組，C 組和 D組 Johnsen 評分均高于 B 組，C 組與 D 組間差異無統計學意義。見表1。

2.2 各組大鼠生精小管中細胞凋亡情況比較 A、B、C 和D 組大鼠生精小管中凋亡細胞個數分別為5.46±0.43、13.84±0.87、7.26±0.57、7.73±0.46，各組差異有統計學意義（F=287.658，P＜0.05）；B 組較A、C和D 組明顯增加（P＜0.05），A、C 和D 組間差異均無統計學意義。凋亡細胞主要見于初級精母細胞和次級精母細胞，見圖1。

2.3 各組大鼠LH 和睪酮水平比較 B 組和D 組大鼠血清LH和睪酮水平較A組顯著降低（P＜0.05），C組大鼠血清LH 和睪酮水平與A 組差異無統計學意義，但較B組升高（P＜0.05）。D組大鼠血清LH水平與B組和C組差異均無統計學意義；D組睪酮水平高于B 組（P＜0.05），與C 組間差異均無統計學意義。見圖2。

2.4 各組大鼠附睪精子參數比較 與A 組比較，B組大鼠附睪精子計數和活力均降低，而異常形態比例升高（P＜0.05）；與B組比較，C組和D組大鼠附睪精子計數和活力均增加，而異常形態降低（P＜0.05）；D組除大鼠附睪精子緩慢前進比例低于C組、不動比例高于C 組外，其余參數與C 組差異均無統計學意義，見表2。

Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各組生精細胞計數和Johnsen評分比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各組生精細胞計數和Johnsen評分比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F生精細胞計數（個）精原細胞11.37±0.54 9.81±0.35a 11.53±0.57b 10.14±0.46b 25.253＊初級精母細胞23.36±0.38 15.02±0.55a 21.53±0.79b 20.15±0.64b 397.911＊次級精母細胞35.26±0.53 18.63±0.68a 33.54±0.97b 27.38±1.03ab 659.061＊精子細胞121.37±0.95 95.57±2.28a 118.54±1.36b 109.73±2.29ab 326.291＊精子83.86±3.17 67.56±1.85a 82.56±1.67b 79.14±2.76b 73.818＊Johnsen評分（分）9.54±0.07 8.36±0.18a 9.34±0.06b 9.06±0.07ab 185.917＊

Fig.1 Immunostaining of seminiferous tubules(TUNEL,×400)圖1 生精小管的免疫染色（TUNEL，×400）

Fig.2 Effects of nicotine and melatonin on serum testosterone and LH levels圖2 尼古丁和褪黑素對大鼠血清LH和睪酮的影響

Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素對附睪精子參數的影響 （n=8，±s）

Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素對附睪精子參數的影響 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F計數（×106/mL）32.53±1.47 23.45±0.76a 33.09±0.87b 29.83±0.81b 150.877＊快速前進（%）10.14±0.16 2.40±0.23a 12.53±0.16b 8.63±0.07b 5 474.09＊緩慢前進（%）38.45±2.17 30.24±2.84a 44.26±2.27b 35.42±2.56bc 44.914＊不動（%）15.13±0.26 30.43±0.45a 10.52±2.47b 18.63±2.96abc 153.115＊總活力（%）63.96±1.25 41.08±1.36a 67.64±1.95b 63.76±2.67b 329.514＊異常形態（%）27.54±1.17 45.54±0.86a 25.86±0.58b 29.65±1.06b 735.802＊

2.5 各組大鼠精子染色質完整性比較 與A 組比較，B組光暈精子比例顯著降低，DNA碎片指數顯著升高（P＜0.05）。與B 組比較，C 組和D 組光暈精子比例均升高，DNA碎片指數均降低（P＜0.05）。D組光暈精子比例與C 組差異無統計學意義，DNA 碎片指數較C組升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素對雄性大鼠精子染色質完整性影響（n=8，±s）

Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素對雄性大鼠精子染色質完整性影響（n=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F光暈精子（%）73.26±1.02 55.87±1.26a 73.64±1.57b 62.51±2.08ab 255.419＊DNA碎片指數（%）12.26±0.54 32.25±0.83a 10.56±0.75b 20.27±0.85bc 1382.947＊

2.6 相關性分析 DNA碎片指數與血清睪酮水平、LH 水平和精子總活力呈負相關（r分別為-0.894、-0.763、-0.786，均P＜0.05），與生殖細胞凋亡、精子異常形態呈正相關（r分別為0.782、0.837，均P＜0.05）。

3 討論

尼古丁為3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑，在睪酮代謝及前列腺中雄激素變化等方面發揮重要作用[3]。以往研究表明，尼古丁可通過降低精子數量、形態、活力和睪丸質量從而在不孕癥中發揮作用[11]。本研究對成年雄性大鼠腹腔注射尼古丁，尼古丁劑量為1 mg/kg，相當于成人每天抽20支煙的血清尼古丁水平[6]。注射30 d后，大鼠精子發生、生殖細胞凋亡、精子參數和精子染色質完整性均發生變化。上述效應的可能原因是，尼古丁可抑制中樞神經系統，從而抑制垂體促性腺激素釋放[11]；而垂體促性腺激素變化又會引起睪丸精子發生和類固醇生成改變。

精子發生是一種激素調節過程，特別是睪酮和促性腺激素，如卵泡刺激素和LH[12]。本研究結果顯示，尼古丁處理大鼠血清睪酮和LH 水平顯著降低。睪酮是精子發生啟始及維持的關鍵激素。LH 是由垂體分泌的，影響睪丸間質細胞并刺激其分泌睪酮。因此，LH水平降低后，睪酮水平也相應降低，本研究結果證實了這一點。另外，本研究結果顯示，尼古丁處理后大鼠生精細胞計數均明顯減少，生精小管中凋亡細胞個數明顯增多，這可能與尼古丁自身毒性以及睪酮和LH水平降低有關；也可能與尼古丁處理后大鼠體內氧化劑，如過氧化氫水平較高有關。目前已經證明，尼古丁可減少睪丸抗氧化水平，并增加睪丸脂質過氧化作用[5]。

另外，本研究對精子染色質完整性進行了評估，以往研究僅通過精子參數評價男性生育狀況是不全面的[12]。精子DNA損傷程度與生育率降低相關[12]；而且氧化應激在單鏈和雙鏈DNA 斷裂中發揮重要作用[13]。Condorelli等[14]研究指出，尼古丁通過降低精子染色質DNA完整性使精子活力和數量減少，并呈劑量和時間依賴性。有研究報道，精子活力和精子DNA 損傷也存在顯著的負相關[15]。本研究結果顯示，尼古丁可使精子形態異常及精子DNA斷裂增加；且DNA碎片指數與血清睪酮水平、LH水平和精子總活力呈負相關，與以往研究結果基本一致。

褪黑素是一種主要由松果體和其他器官合成的激素，如視網膜及淚腺。睪丸組織中褪黑素濃度與身體其他組織中類似[12]。研究表明，褪黑素具有抗氧化和捕獲自由基的能力[12]。體外研究表明，褪黑素也可改善化療小鼠精子發生和精子參數[16]，褪黑素處理可提高精液質量[17]。上述研究提示褪黑素對精子具有保護作用。本研究中褪黑素劑量為10 mg/kg，與文獻[2]中的劑量相同，結果顯示，褪黑素可改善尼古丁處理大鼠精子發生和精子參數，可能與褪黑素的抗凋亡和抗氧化作用有關。褪黑素也可影響下丘腦-垂體-性腺軸和調節性激素分泌，如雌激素、睪酮和LH。本研究中褪黑素也可顯著提高睪酮和LH水平，并改善DNA碎片指數，提示可能與褪黑素對睪丸間質細胞的直接作用有關。此外，褪黑素也可改善尼古丁處理大鼠精子染色質完整性，提示精液中褪黑素可能與睪酮和抗氧化酶之間存在關聯[18]。

綜上所述，褪黑素可通過減少生殖細胞凋亡和調節睪酮水平改善尼古丁處理大鼠精子發生數量、質量和精子染色質完整性，但其具體作用機制有待于進一步研究驗證。