中度限食對肥胖小鼠胰島β細胞分泌功能的影響

高秀瑩，周迎生，朱巍

肥胖是2 型糖尿病公認的危險因素，肥胖不僅可引起外周胰島素抵抗，而且會導致胰島β 細胞功能紊亂，具體表現為胰島素分泌受損，早期并不伴β細胞數量的下降[1]。限食（calorie restriction，CR），即每天固定限制熱量攝入，對肥胖、2型糖尿病采用最多的限食方式是將每日熱量攝入減少15%～40%，即攝入熱量約1 200～1 800 kcal/d，長期維持。亦有一些研究采用的極低熱量飲食（＜800 kcal/d，即將每日熱量攝入減少約50%～70%），短期干預[2-4]。目前對于限食的程度尚無具體的分級標準，本研究參照文獻[5]，將極低熱量飲食稱為重度限食，將30%～50%限食稱為中度限食，將＜30%限食稱為輕度限食。臨床研究顯示，重度限食可改善甚至逆轉肥胖和2 型糖尿病患者中存在的β細胞功能紊亂。部分研究給予極度肥胖的2 型糖尿病患者短期極低熱量飲食（400 kcal/d，1周[2]或500 kcal/d，3周[3]），可改善胰島素分泌紊亂。最近的一項研究給予30 例超重或肥胖的2 型糖尿病患者8 周的極低熱量流質飲食（624 kcal/d），可使40%的患者糖尿病完全緩解，并恢復第一時相胰島素分泌[4]。然而因重度限食有營養不良、低血糖、電解質紊亂等不良反應，致使患者難以長期堅持，且終止后易出現體質量反彈[6]，目前國內外指南均不推薦2型糖尿病患者長期接受極低熱量飲食[7-8]。而對肥胖患者或動物模型輕中度限食的研究，則主要關注其對胰島素抵抗的改善[9-12]，而缺乏對胰島β細胞功能的深入探討。目前輕中度限食能否逆轉肥胖誘導的β細胞功能紊亂尚不明確。因此，本研究采用飲食誘導的肥胖小鼠為模型，進行中度（40%）限食干預，使其體質量恢復正常，通過在體和離體胰島實驗明確中度限食能否從形態和功能上逆轉肥胖對β細胞的損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡雄性C57BL/6小鼠80只，體質量9～11 g，購于北京維通利華公司，飼養于首都醫科大學SPF級實驗動物房，許可證號：SCXK（京）2012-0001，動物合格證號：11400700057273。普通飼料及高脂飼料均購自美國Research Diets公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 膠原酶Ⅺ、Histopaque 1077、胎牛血清均購自美國Sigma 公司；RPMI 1640培養基、DMEM 培養基均購自美國Gibco 公司；牛血清白蛋白購自美國Amresco 公司；小鼠超敏胰島素酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自美國Alpco 公司；鼠源胰島素單克隆抗體購自美國Santa cruz公司；兔/鼠通用型鏈親和素-辣根過氧化物酶試劑盒購自北京康為世紀公司；其他試劑均為分析純，購自北京化工廠。SD111 型體視顯微鏡購自重慶重光公司；3111 型CO2培養箱購自美國Thermo公司；DMI 4000B型倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司；ECLIPSE 80i/90i型正置顯微鏡購自日本Nikon公司；Synergy4型多功能酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 小鼠予以普通飼料適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為對照組（NC AL組，n=20）和高脂組（n=60）。對照組飼喂普通飼料（D12450J，脂肪供能比10%，16.1 kJ/g），高脂組飼喂高脂飼料（D12492，脂肪供能比60%，21.9 kJ/g），均喂養8周，高脂組出現典型肥胖，體質量均值≥對照組體質量均值35%作為飲食誘導肥胖（diet-induced obese，DIO）小鼠成模的標準。其后將高脂組隨機分為以下3組（n=20）：高脂對照組（HF AL組，繼續自由進食高脂飼料）、高脂轉普食組（HF→NC 組，換為普通飼料，自由進食）、高脂限食組[HF→NC CR 組，進食普通飼料，每日喂食量=正常對照組每日攝食量（前3 d平均值）×60%]。NC AL組繼續自由進食普通飼料，所有動物均自由飲水。限食組小鼠經預實驗確定限食干預時間為3 周（此時，HF→NC CR 組的體質量接近NC AL組）。

1.2.2 腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT）和胰島素耐量試驗（ITT） IPGTT：小鼠禁食過夜16 h，給予腹腔注射25%葡萄糖（2 mg/g），鼠尾采血，分別測定空腹及糖負荷后15、30、60、120 min 的血糖及胰島素水平。并計算：（1）胰島素生成指數=[15 min 胰島素-空腹胰島素（μg/L）]/[15 min 血糖-空腹血糖（mmol/L）]，評估早時相胰島素分泌[13]。（2）梯形面積法計算0～120 min血糖曲線下面積（AUC血糖）和胰島素曲線下面積（AUC胰島素），評估第二時相胰島素分泌。ITT：小鼠不禁食，腹腔注射0.75 IU/kg 重組人胰島素注射液，分別測定注射前及注射后15、30、60、120 min的血糖水平，并分別計算注射后15、30、60、120 min的血糖占基線（注射前）血糖的百分比。

1.2.3 胰腺組織胰島素免疫組化染色及定量 實驗終點取小鼠胰腺，常規石蠟包埋，5 μm切片，切片脫蠟至水，抗原修復，滅活內源性過氧化物酶，封閉，滴加鼠源胰島素一抗（1∶400稀釋），4 ℃濕盒過夜，次日滴加生物素標記羊抗鼠二抗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，脫水，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并采集圖像，以細胞胞漿棕黃染色為胰島素陽性細胞。每組5只小鼠，每只小鼠隨機選取10張切片（2張切片間隔至少200 μm，避免重復測量同一個胰島），應用NISElements 專業圖像分析軟件計算胰腺β 細胞面積（%）=胰島素陽性染色面積/切片中胰腺組織面積。

1.2.4 小鼠胰島的分離、純化 實驗終點每組取10只小鼠分離胰島。1%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，體視顯微鏡下，通過膽總管穿刺、逆行灌注膠原酶Ⅺ（1.5 g/L）[14]，使胰腺充分內消化，迅速摘取整個胰腺，放入50 mL 離心管中，37 ℃水浴消化10 min，加入40 mL預冷的Hank's平衡鹽溶液（HBSS），搖勻終止消化，1 400 r/min 離心15 s，棄上清，共洗滌3 次，第3 次洗滌后經600 μm 不銹鋼濾網過濾，然后加7 mL Histopaque 1077重懸沉淀，沿管壁輕輕加入7 mL DMEM，2 300 r/min離心10 min，小心吸出中間層的胰島至含有HBSS的培養皿中，體視顯微鏡下，用移液槍人工挑取胰島。每150個胰島加入6 mL RPMI 1640 完全培養基，過夜培養恢復，倒置顯微鏡下拍照，應用Image-Pro Plus 3.0 軟件測量胰島直徑，將胰島直徑分為3個等級：50～＜100 μm，100～200 μm，＞200 μm，計算不同組間胰島各個等級的分布比例。

1.2.5 離體胰島葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）及胞漿胰島素含量測定 GSIS：過夜培養的胰島換含0.5%BSA的KRB緩沖液，于CO2培養箱中預孵育1 h，體視顯微鏡下，吸取包膜完整、大小一致的胰島種于24 孔板，每孔10 個，分別加入含2.8 mmol/L、16.7 mmol/L 葡萄糖的刺激液，每個濃度設 3 個復孔，于CO2培養箱孵育1 h，冰上終止胰島素分泌，吸取上清-80 ℃保存，ELISA 法待測胰島素濃度。胞漿胰島素含量測定：GSIS 刺激前，收集 5 個胰島至 1.5 mL EP 管中，每只小鼠采樣3 次，加入1 mL 冰的酸-乙醇溶液（鹽酸1.5%，乙醇75%，蒸餾水23.5%），渦旋15 s，反復凍融后超聲破碎3 次，4 ℃裂解過夜，次日4 ℃13 000 r/min離心20 min，吸取上清-80 ℃保存，ELISA法檢測胰島素濃度。

1.3 統計學方法 所有數據應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 限食對小鼠體質量的影響 經過8周的高脂喂養，高脂組小鼠顯著肥胖，體質量較NC AL組增加了45.1%，均成功建立了DIO模型。經過3周的限食干預，HF→NC CR 組小鼠的體質量恢復正常。對于HF→NC 組，盡管實驗終點時較HF AL 組小鼠體質量下降了26.1%，但與NC AL 組相比，體質量仍未降至正常，見圖1。

Fig.1 The changes of body weights during the experiment in the four groups圖1 實驗進程中各組小鼠體質量變化

2.2 限食對糖耐量、早時相和第二時相胰島素分泌及胰島素敏感性的影響 與NC AL 組比較，HF AL組糖負荷后15、30、60、120 min 的血糖、胰島素及血糖占基線的百分比均明顯升高；與HF AL 組比較，HF→NC 組和 HF→NC CR 組糖負荷后 15、30、60、120 min的血糖、胰島素及血糖占基線的百分比均明顯降低（均P＜0.05），見圖2。與NC AL 組比較，HF AL 組小鼠的空腹血糖、空腹胰島素、AUC血糖和AUC胰島素均明顯升高（均P＜0.05）；與HF AL 組比較，HF→NC組和HF→NC CR組小鼠的空腹血糖、空腹胰島素、AUC血糖和AUC胰島素均降低（均P＜0.05），且除HF→NC 組空腹胰島素仍高于NC AL 組外，其余指標均恢復至正常。HF→NC CR 組胰島素生成指數高于HF AL組（P＜0.05），其余組胰島素生成指數差異均無統計學意義，見表1。

Fig.2 Intraperitoneal glucose tolerance test and insulin tolerance test圖2 IPGTT及ITT

Tab.1 Effects of calorie restriction on β-cell function表1 限食對β細胞功能的影響 （±s）

Tab.1 Effects of calorie restriction on β-cell function表1 限食對β細胞功能的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NC AL組比較，b與HF AL組比較，P＜0.05

組別NC AL組HF AL組HF→NC組HF→NC CR組F n8866空腹血糖（mmol/L）4.9±1.2 7.9±2.2a 5.8±0.7b 5.7±1.5b 7.822＊＊空腹胰島素（μg/L）0.18±0.05 0.74±0.14a 0.29±0.07ab 0.20±0.07b 51.520＊＊AUC血糖（mmol/L×min）880.1±119.4 1 768.3±166.8a 1 077.2±136.5b 569.9±100.0b 16.249＊＊胰島素生成指數0.026±0.003 0.015±0.010 0.028±0.004 0.044±0.010b 2.497＊AUC胰島素（μg/L×min）22.66±1.92 34.86±2.34a 25.74±3.86b 24.54±2.70b 3.647＊

2.3 限食對胰島β 細胞面積的影響 HF AL 組胰島β 細胞面積較NC AL 組增加了3.3 倍（P＜0.05）；HF→NC 組胰島β 細胞面積雖較HF AL 組降低，但仍高于NC AL組（P＜0.05）；HF→NC CR組胰島β細胞面積較HF AL組降低（P＜0.05），且與NC AL組差異無統計學意義。見圖3。

Fig.3 Effects of calorie restriction on islet β-cell area圖3 限食對β細胞面積的影響

2.4 限食對離體胰島形態的影響 體外分離的胰島經過夜培養后包膜完整、呈自然的棕黃色，可用于后續的功能實驗，見圖4A。每只小鼠可分離出200～400個胰島，大多數胰島的直徑分布在100～200 μm。HF AL 組胰島明顯肥大，＞200 μm 的胰島比例較NC AL 組增高（P＜0.05）；HF→NC 組和HF→NC CR組胰島的分布比例均恢復正常，見圖4B。

2.5 限食對離體胰島GSIS 及胞漿胰島素含量的影響 HF AL組胰島表現為缺陷性的胰島素分泌，即：與NC AL組相比，基礎胰島素分泌增加了30.6%，而高糖刺激的胰島素分泌降低了52.1%（P＜0.05）。HF→NC組胰島盡管基礎胰島素分泌恢復至正常水平，但高糖刺激的胰島素分泌較HF AL 組并無改善（P＞0.05）。經過限食干預后，HF→NC CR組胰島的基礎和高糖刺激的胰島素分泌均恢復正常，見圖4C。HF AL組單個胰島的胰島素含量較NC AL組增加了28.3%（P＜0.05），HF→NC 組和HF→NC CR 組的胞漿胰島素含量均降至正常水平，見圖4D。

Fig.4 Effects of calorie restriction on the morphology and function of isolated islets圖4 限食對離體胰島形態及功能的影響

3 討論

目前，肥胖已成為嚴重的公共衛生問題[15]。肥胖對胰島β 細胞的損傷表現為早期代償性增生、胰島素高分泌，逐漸出現胰島素分泌時相受損，繼而出現β 細胞形態改變及數量下降，逐步進展到β 細胞功能衰竭的終末狀態。研究證實在胰島β細胞僅有分泌功能障礙，而未出現顯著的組織學改變之前，早期干預，其功能受損是可逆的。限食能有效減低體質量，改善β 細胞功能[16]。研究顯示，重度限食（極低熱量飲食）可快速逆轉肥胖和2 型糖尿病患者中存在的β細胞功能紊亂，恢復第一時相胰島素分泌，甚至使部分患者的糖尿病完全緩解[4，17-18]。

本研究成功建立了飲食誘導的肥胖小鼠模型，結果顯示，HF AL組出現糖耐量受損，胰島β細胞面積及胞漿胰島素含量代償性增加，而早時相胰島素分泌趨向降低、第二時相胰島素分泌顯著升高，這種現象常見于糖耐量異常及早期的2 型糖尿病患者[19]，與此一致的是，該組離體胰島實驗亦顯示高糖刺激的胰島素分泌障礙，這與既往研究結果相符[20-21]，提示高脂組的β 細胞功能紊亂并非由于胰島素儲備不足，而是由于缺陷性的分泌。

本研究對飲食誘導的肥胖小鼠進行中度限食或高脂飲食轉為普通飲食干預，結果顯示，經過3 周40%的限食干預，HF→NC CR 組小鼠體質量降至正常，并且糖耐量、胰島素分泌和胞漿胰島素含量均恢復正常。與重度限食的不良反應和體質量反彈相比，本研究采用的中度限食策略，易被患者接受，體質量反彈少[22]，可行性強。盡管重度限食研究和本研究所采用的限食方式和干預時間不同，均證實在肥胖和2型糖尿病的早期階段，限食干預能夠逆轉β細胞功能紊亂。

本研究中，高脂飲食轉為普通飲食3周后，HF→NC組小鼠的糖耐量恢復正常，體質量有所降低但未正常，同時，該組小鼠的早時相胰島素分泌及離體胰島高糖刺激的胰島素分泌較HF AL 組并無改善。Agardh等[23]研究表明DIO小鼠經高脂飲食轉為低脂飲食4 周，可使糖耐量正常，體質量降低，這與本研究相符，然而，與本研究結果不同的是，該研究顯示早時相胰島素分泌亦有改善，造成這種差異的原因可能與該研究干預時間較長有關。此外，既往多個研究顯示，使血糖恢復正常需較短的干預時間，而使胰島素分泌恢復正常則需較長的干預時間[10，17]，正如HF→NC 組小鼠所示，盡管它們的血糖已經恢復正常，但仍存在胰島素分泌缺陷。這也提示除使血糖恢復正常之外，重建β細胞功能亦應作為肥胖和2型糖尿病干預研究的的主要終點和靶點。

綜上所述，40%的中度限食干預至體質量正常，能逆轉飲食誘導肥胖小鼠的胰島β細胞分泌功能紊亂，重建葡萄糖穩態。本研究支持在肥胖和2 型糖尿病的早期階段，僅通過飲食干預即可逆轉β 細胞功能障礙，并為限食應用于臨床實踐提供了參考依據。進一步闡明限食對β細胞保護的機制將為2型糖尿病的防治提供有效的靶點。