硫氫化鈉對糖尿病心肌病大鼠心臟保護作用及對JNK/FoxO1/Bcl-2信號通路的影響

易登良，曾奇虎，劉星，王濤，范忠才△

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是由長期慢性高血糖引起的心肌廣泛代謝障礙性疾病，是糖尿病患者常見且嚴重的并發癥之一。DCM主要病理特征為心肌肥厚及心肌間質纖維化，早期主要表現為無癥狀性心室舒張功能減退、順應性下降，逐漸進展到心室收縮功能障礙，進而出現心力衰竭的癥狀，最終發展為難治性的心力衰竭。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種內源性氣體信號分子，在心肌細胞可通過胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）影響L-半胱氨酸產生，對心血管具有保護作用[1]。研究發現，糖尿病大鼠模型血液循環中H2S 水平顯著降低[2]，且激活 CSE 蛋白可減輕 DCM 的心肌損傷[3]。此外，大量研究表明，外源性H2S可通過調控細胞凋亡、氧化應激、細胞自噬、炎癥反應等通路來改善DCM大鼠心肌間質纖維化，保護心臟功能[4]，然其具體機制仍不明確。故本實驗通過建立DCM 大鼠模型，運用外源性H2S（以NaHS代替）干預來進一步探討其對DCM的作用及相關機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 8 周齡SPF 級成年健康雄性SD 大鼠44 只，體質量（200±20）g，購自西南醫科大學動物實驗中心，所有操作均遵循西南醫科大學實驗動物操作規程，飼養期間自由進食及飲水；高糖高脂飼料（配方：10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黃粉、61%常規飼料）由成都達碩飼料公司提供，許可證編號：蘇飼審（2009）05032；NaHS（13590）和鏈脲佐菌素（STZ，S0130）購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）及Western blot 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Bcl-2（ab692）兔抗大鼠單克隆抗體、p-FoxO1（ab47326）兔抗大鼠多克隆抗體、p-JNK（ab124956）兔抗大鼠單克隆抗體均購自Abcam 公司；本研究經醫院倫理委員會批準，符合動物倫理相關規定。

1.2 造模及分組 實驗采用析因設計方法，見表1。44 只實驗動物均適應性喂養1周，隨機數字表法抽取其中24只大鼠予以高糖高脂飲食喂養4 周，經禁食12 h 后一次性以STZ 40 mg/kg 腹腔注射，72 h 后使用羅氏卓越型快速血糖儀檢測尾靜脈血糖，以血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功，成功構建糖尿病大鼠模型19只，隨后再以普通飲食喂養6周構建糖尿病心肌病模型。隨機數字表法抽取16只DCM模型及16只正常大鼠，依干預方式不同分為4組：DCM+0.9%氯化鈉組（DCM+Saline 組）、DCM+硫化氫組（DCM+NaHS 組）、正常大鼠+0.9%氯化鈉組（Control+Saline 組）、正常大鼠+硫化氫組（Control+NaHS 組），每組8 只大鼠。隨后DCM+NaHS 組和Control+NaHS 組大鼠腹腔注射NaHS 溶液100 μmol/（kg·d）（濃度12 mmol/L，體積8.3 mL/kg），DCM+Saline 組和Control+Saline組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續12周。

Tab.1 The experimental factors and levels and specific intervention programs of each treatment group表1 實驗因素、水平及各處理組的具體干預方案

1.3 心臟超聲檢查 各組分別于實驗干預結束后使用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉，麻醉后行動物心臟超聲檢查，使用彩色多普勒超聲顯像儀（GE Vivid E9），探頭頻率3.5 MHz，主要記錄的參數包括左室舒張末內徑（LVIDd）、左室收縮末內徑（LVIDs）、左室射血分數（LVEF）、左室縮短分數（LVFS）等。

1.4 心臟組織病理觀察 各組大鼠在行心臟超聲結束后隨即處死，經胸骨正中逐層切開，取出心臟，用生理鹽水清洗并分離心室肌，沿左室中線將心臟分為2部分，在心尖部取出厚度約2 mm 的心肌，于4%多聚甲醛溶液中固定并石蠟包埋，采用HE染色及Masson 染色制作成病理切片，普通光學顯微鏡（×200）下觀察心臟組織病理學改變，使用Olympus cell Sens Standard 顯微鏡圖像軟件采集圖像。余心臟組織凍存于-80 ℃。

1.5 使用 Western blot 法檢測心臟組織Bcl-2、p-FOXO1、p-JNK蛋白表達 取心臟組織，每100 mg加入預冷組織裂解液1 mL，超聲破碎儀中（冰浴）勻漿后離心取上清液，使用BCA法檢測蛋白濃度。充分混合的上清加5×蛋白上樣緩沖液后于100 ℃煮沸變性10 min，保存于-20 ℃冰箱。將變性好的組織樣品冰上溶解后以20 μL 總蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳后使用半干法轉膜至PDVF 膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗去封閉液，洗膜3 次，每次8 min。分別加已稀釋一抗兔抗大鼠 Bcl-2（1∶1 000）、p-FOXO1（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，回收已稀釋的一抗，用TBST（pH=7.6）洗膜3 次，每次8 min；運用HRP 標記的羊抗兔二抗（1∶3 000）37 ℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min，ECL顯色、曝光，保存膠片。使用Quantity one軟件分析目的條帶光密度（OD）值，使用β-actin條帶進行OD校正。

1.6 統計學方法 采用SPSS 18.0 統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，采用2×2析因設計方差分析進行比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

實驗干預過程中DCM+Saline組、DCM+NaHS組分別死亡1 只大鼠。DCM+Saline 組中的2 只大鼠、DCM+NaHS組中的1只大鼠未采集到合格的心臟超聲圖像。

2.1 各組心臟超聲結果比較 糖尿病和硫氫化鈉均對大鼠的心功能指標有影響，且存在交互作用（P＜0.05）；其中，與Control 組比較，DCM 組無論是否加用 NaHS 均可導致 LVEF、LVFS 下降，而 DCM+NaHS 組較 DCM+Saline 組的 LVEF、LVFS 明顯升高（P＜0.05），見圖1，表2。

Fig.1 Comparison of ultrasonic cardiogram results between different rat heart groups圖1 各組大鼠心臟超聲結果比較

Tab.2 Comparison of ultrasonic cardiogram results between different rat heart groups表2 各組大鼠心臟超聲結果比較 （±s）

Tab.2 Comparison of ultrasonic cardiogram results between different rat heart groups表2 各組大鼠心臟超聲結果比較 （±s）

＊＊P＜0.01；組間多重比較各指標差異均有統計學意義

組別Control+Saline組Control+NaHS組DCM+Saline組DCM+NaHS組n8856 FAFB FA×B LVEF 0.775±0.030 0.779±0.027 0.598±0.055 0.708±0.028 17.683＊＊83.172＊＊15.435＊＊LVFS 0.395±0.021 0.421±0.027 0.278±0.019 0.355±0.019 34.522＊＊108.744＊＊8.340＊＊

2.2 各組心臟組織病理改變 Control+Saline 組、Control+NaHS 組大鼠心肌細胞形態規則、膠原排列整齊；DCM+Saline 組大鼠心肌細胞明顯肥大，膠原排列紊亂，心肌間藍染的膠原纖維增加；而DCM+NaHS 組較DCM+Saline 組相比，心肌細胞肥大及膠原排列紊亂得到改善，見圖2、3。

Fig.2 Comparison of pathological results between different rat heart groups(HE staining,×200)圖2 各組心臟組織病理組織的改變情況（HE染色，×200）

Fig.3 Comparison of pathological results between different rat heart groups(Masson staining,×200)圖3 各組心臟組織病理組織的改變情況（Masson染色，×200）

2.3 各組心臟組織p-JNK、p-FoxO1、Bcl-2 蛋白的表達水平比較 糖尿病和硫氫化鈉對大鼠心臟組織p-JNK、p-FoxO1、Bcl-2 蛋白的表達均有影響，且對p-FoxO1、p-JNK 表達存在交互作用（P＜0.05）。其中，與Control+Saline 組比較，DCM 組無論是否加用NaHS，均存在p-JNK表達明顯增加，Bcl-2、p-FoxO1表達明顯下降（P＜0.05）；而Control+NaHS 組對p-JNK蛋白表達無影響（P＞0.05），但可使Bcl-2蛋白、p-FOXO1 蛋白表達增加（P＜0.05）；此外，DCM+NaHS 組 p-JNK 表達下降，Bcl-2、p-FOXO1 表達增加（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

Fig.4 Expression of Bcl-2,p-JNK and p-FOXO1 in rat heart in four groups圖4 各組大鼠心臟組織Bcl-2、p-JNK、p-FOXO1蛋白表達情況

Tab.3 Expression of Bcl-2,p-JNK and p-FOXO1 in rat heart in four groups表3 各組心臟組織Bcl-2、p-JNK、p-FOXO1表達情況比較 （±s）

Tab.3 Expression of Bcl-2,p-JNK and p-FOXO1 in rat heart in four groups表3 各組心臟組織Bcl-2、p-JNK、p-FOXO1表達情況比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control+Saline組p-JNK組間比較差異無統計學意義，其他各指標組間多重比較差異均有統計學意義

?

DCM 是糖尿病常見且嚴重的并發癥，可導致患者心臟舒縮功能受損，出現心力衰竭、心律失常、甚至猝死[4]。現在越來越多的證據表明，外源性H2S可以改善 DCM 心臟功能[5]。本研究結果顯示，與Control 組比較，DCM 組無論是否加用 NaHS 均可導致LVEF、LVFS下降、心肌組織肥大、膠原排列紊亂、心肌間藍染的膠原纖維增加，表明糖尿病心肌病的確存在心臟病理組織及舒縮功能的受損；此外，DCM+NaHS 組的 LVEF、LVFS 較 DCM+Saline 組明顯升高，心肌病理組織學變化得到明顯改善，同樣也表明了NaHS 對DCM 大鼠心臟的保護作用，但目前其具體機制仍不明確。

細胞凋亡是基因控制細胞的自主的有序的死亡過程，具有明顯的形態學特征，包括細胞體積縮小、線粒體膜電位下降、染色體凝聚和DNA 片段化等，在機體內受到多種細胞內外因素調節，其在心血管疾病的發生發展中扮演著重要的角色[6]。Caspase家族是促進細胞發生凋亡的主要酶類，通過Caspase基因層層激活，最終導致細胞凋亡，是一切凋亡傳導的共同信號通路，其中以Caspase-3最為關鍵[7]。研究發現，通過對DCM 心肌組織行TUNEL 法檢測可見DNA 鏈普遍斷裂，蛋白電泳可見Caspase-3 蛋白表達明顯增加，均證實了凋亡與DCM 密切相關[8]。此外，研究顯示在DCM大鼠模型中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 表達下降、促凋亡基因Bax mRNA 表達增加，而外源性H2S 干預可以上調Bcl-2 mRNA 表達、下調Bax mRNA表達保護心臟功能[9]。本實驗顯示，糖尿病和硫氫化鈉對大鼠心臟組織Bcl-2 蛋白的表達均有影響，但兩者不存在交互作用；其中，與Control+Saline 組比較，DCM+Saline 組的 Bcl-2 蛋白表達減少，與 DCM+Saline 組比較，DCM+NaHS 組Bcl-2蛋白表達增加，提示NaHS 可能通過激活Bcl-2，抑制細胞凋亡，保護心臟功能。

FoxO1 轉錄因子隸屬于叉頭轉錄因子（FOXO）亞家族，主要調控細胞增殖、分化、凋亡、DNA 損傷/修復、氧化應激、糖代謝等相關機制，在DCM的發生發展中扮演著重要的角色[10]。其中PI3K/AKT 信號通路可以使FoxO1 磷酸化及去磷酸化，磷酸化時FoxO1 由細胞質進入細胞核與靶基因相應區域結合，激活轉錄活性從而行使其轉錄功能[11]。研究發現，FoxO1 可以解除 PPAR-γ2 對 GluT-4 基因的阻遏，促進GluT-4 的表達，改善糖代謝[12]；此外，在2型糖尿病中FoxO1 的去磷酸化增加，并可協同NF-κB 上調炎癥因子IL-1β 的表達，進而損壞胰島β 細胞的功能。本實驗結果顯示，糖尿病和硫氫化鈉對大鼠心臟組織p-FoxO1 蛋白的表達均有影響，兩者存在交互作用；其中，與Control+Saline 組比較，DCM+Saline 組的p-FoxO1 蛋白表達減少，與DCM+Saline 組比較，DCM+NaHS 組 p-FoxO1 蛋白表達增加，提示NaHS 對心臟的保護作用可能通過過表達FoxO1蛋白來發揮作用。

c-Jun 氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶中的一個亞類，參與細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞凋亡與惡變等多種生物學反應，其中在心肌細胞中JNK 是細胞凋亡發生的一個關鍵因子[13]。Liu等[14]研究發現，糖尿病組大鼠心肌組織中的JNK表達水平較正常組明顯增加，提示JNK 通路可能加速了糖尿病心肌纖維化的進展。此外也有研究提出高糖增加了AC16 人類心肌細胞內源性JNK 及Caspase-3 的表達，而使用 JNK 阻斷劑 SP600125 則抑制了細胞凋亡及Caspase-3的活化，提示JNK通路可能是治療DCM的新靶點[15]。本實驗發現，糖尿病和硫氫化鈉對大鼠心臟組織p-JNK蛋白的表達均有影響，兩者存在交互作用，其中，與Control+Saline 組比較，DCM+Saline 組的p-JNK 蛋白表達增加，與DCM+Saline 組比較，DCM+NaHS 組p-JNK蛋白表達減少，提示NaHS 對心臟的保護作用可能通過下調JNK蛋白的表達來發揮作用。

綜上所述，DCM 所致的心肌損傷與細胞凋亡密切相關，外源性H2S可以改善DCM的心肌損傷，保護心臟功能，其可能通過作用于JNK/FoxO1/Bcl-2信號通路實現。但本實驗僅初步探討了H2S在DCM中對相關分子的影響及作用，其具體機制及相關信號通路仍需要深入研究。