橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12氧化應激損傷的保護作用

李文杰，李靜

(1.鄭州人民醫院，河南 鄭州 450003； 2.黃河中心醫院，河南 鄭州 450003)

缺血性腦血管病腦在缺血后再恢復血氧供應時往往伴隨著缺血后的再灌注(I/R)損傷，導致進一步的神經功能障礙。I/R損傷時病理生理機制復雜，其中由于氧化應激及氧自由基損傷最終引起細胞凋亡在腦缺血疾病的發生發展中起到非常重要的作用[1]。因此探索具有抗氧化作用的化合物具有重要的現實意義。橄欖苦苷是油橄欖樹主要成分，是一種無毒的裂環烯醚萜苷類化合物。目前，人們對橄欖苦苷的藥理作用及臨床應用進行了廣泛的研究，文獻表明橄欖苦苷具有腎臟/心臟保護作用、抗癌、保肝及抗阿爾茨海默病等藥理活性[2]。此外橄欖苦苷還具有一定的抗炎[3]、抗氧化能力[4]。但對橄欖苦苷在腦缺血再灌注損傷保護作用研究尚少，特別是分子水平的作用機制尚不完全清楚。本研究擬以H2O2誘導的PC12細胞為模型，探索橄欖苦苷對氧化應激損傷的保護作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

橄欖苦苷(Funakoshi，日本)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、H2O2、二甲基亞砜(DMSO)、SOD及GSH-PX ELISA Kit(武漢默沙克生物科技有限公司)；RPMI-1640培養液及FBS(GIBCO)；0.25%胰蛋白酶、蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒TUNEL試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Cyt-c、 Caspase-3鼠抗人單克隆抗體和β-Actin(美國Santa Cruz公司)；細胞培養箱(德國)；高速低溫離心機(德國HERMLE公司)；酶標儀(中國Motic)。

1.2 細胞培養

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞購自中科院上海細胞庫，接種于含10%FBS、10萬U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 RPMI-1640培養液中，37℃、5%CO2條件下培養。按常規方法消化、傳代，取對數期細胞為實驗對象。

1.3 MTT法檢測橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞活力的影響

細胞分為空白對照組、模型組、橄欖苦苷組。對數期的PC12細胞鋪96孔細胞培養板7 000個/孔，37 ℃、5% CO2孵育箱孵育培養24 h，棄舊培養液，加入含200 μmol/L H2O2的新鮮培養液培養6 h，棄培養液，給予新鮮培養液培養24 h。藥物組給予含10、50、100、200 μmol/L橄欖苦苷的新鮮培養液，模型組給予空白新鮮培養液，空白對照組除不給予H2O2預處理及不加入藥物外，其他處理同上。每組重復6次。繼續培養24、48、72 h。加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL/孔，孵育箱繼續孵育4 h，棄去舊培養液，加入DMSO溶液100 μL/孔，遮光振搖10 min，充分溶解甲臢。利用酶標儀在490 nm處檢測各孔的OD值。藥物設定濃度參考文獻[5]。

1.4 TUNEL法檢測橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞凋亡率的影響

細胞分組及預處理參照“1.3項”。藥物組分別加入含50、100、200 μmol/L橄欖苦苷的新鮮培養液，模型組及空白對照組處理參照“1.3項”。每組重復6次。繼續培養24、48、72 h，棄培養液，0.25%胰酶消化細胞，轉移至EP管，離心，棄上清，4%多聚甲醛固定PC12細胞，放置于搖床上振動0.5～1 h。加入用含0.1% Triton X-100的PBS制成細胞懸液，冰上孵育5 min，采用流式細胞術技術，根據TUNEL試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.5 ELISA法檢測橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞內SOD及GSH-PX活力的影響

細胞分組及預處理參照“1.3項”。藥物組分別加入含50、100、200 μmol/L橄欖苦苷的新鮮培養液，模型組及空白對照組處理參照“1.3項”。 每組重復6次。各組細胞孵育48 h，傾去舊培養基，0.25%胰酶消化細胞，轉移至EP管，加入裂解液裂解細胞，離心，取上清作為待測樣品。以上操作均在冰浴下進行，防止蛋白降解。SOD的活力(U/mg protein)和GSH-PX的活性( mU/mg protein)根據SOD及GSH-PX ELISA Kit 說明書進行操作。

1.6 Westing blot法檢測Caspase-3、Cyt-C表達

細胞分組及預處理參照“1.3項”。取對數生長期PC12細胞接種于培養瓶中，37℃、5% CO2條件下孵育。藥物組分別加入含50、100、200 μmol/L橄欖苦苷的新鮮培養液，模型組及空白對照組處理參照“1.3項”。 每組重復6次。各組細胞孵育48 h。收獲細胞，加入適量含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰浴裂解25 min，收集細胞，低溫高速離心25 min(4℃，25 000 r/min)，吸取上清轉貯至專用EP管，-20℃冰箱保存備用。至于100℃熱水變性10 min，蛋白濃度利用Bradford法來測定。制備10% SDS-PAGE ，電泳分離蛋白，電轉至PVDF膜，TBST洗滌PVDF膜3次，10 min/次，置于5%脫脂奶粉溶液中，4℃封閉2 h，一抗Cyt-C、Caspase-3抗體1∶1 000稀釋，4℃過夜，二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h，ECL法顯色，采用凝膠成像系統進行圖像量化分析。

1.7 統計學處理。

2 結果

2.1 MTT法檢測橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞活力的影響

結果見表1。與空白對照組比較，模型組細胞OD值顯著降低(P<0.01)，差異具有統計學意義。給予50、100、200、400 μmol/L的橄欖苦苷作用24、48、72 h后，與模型組比較，各濃度的OD值明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.01)，表明橄欖苦苷能夠抑制H2O2誘導的PC12細胞活力的降低。同時發現，當橄欖苦苷濃度為400 μmol/L時，細胞活力有下降趨勢，表明高濃度的橄欖苦苷對細胞的增殖具有一定的抑制作用。基于此結果，采用50、100、200 μmol/L的橄欖苦苷進行后續實驗。

組別濃度(μmol/L)n24 h48 h72 h空白對照組51.37±0.232.04±0.162.39±0.21模型組50.46±0.09**0.68±0.10**1.18±0.13**橄欖苦苷組5050.59±0.130.84±0.10△1.44±0.20△10050.80±0.10△△1.15±0.19△△1.62±0.22△△20051.08±0.20△△1.38±0.26△△1.78±0.23△△40050.90±0.21 △△1.26±0.25△△1.65±0.25△△

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

2.2 TUNEL法檢測橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞凋亡率的影響

結果見表2。橄欖苦苷組給予不同濃度(50、100、200 μmol/L)的橄欖苦苷分別作用24、48、72 h，與空白對照組比較，模型組的細胞凋亡率增加(P<0.01)，差異具有統計學意義。與模型組比較，橄欖苦苷組的細胞凋亡率降低(P<0.05,P<0.01)，凋亡率隨著藥物濃度增加及作用時間的延長逐漸降低。表明橄欖苦苷能夠抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡率的增加。

組別濃度(μmol/L)n24 h48 h72 h空白對照組58.89±0.569.87±1.0510.69±0.89模型組520.46±2.00**21.34±2.29**20.24±1.79**橄欖苦苷組50516.50±0.88△△14.82±1.04△△15.54±1.66△△100514.80±1.38△△12.98±1.25△△12.28±1.25△△200513.22±1.00△△10.54±1.91△△11.09±0.93△△

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

2.3 橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞內超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)活力的影響

表3 橄欖苦苷SOD及GSH-PX活力的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

結果見表3。與空白對照組比較，模型組細胞內SOD、GSH-PX活性顯著降低(P<0.01，P<0.01)，差異具有統計學意義。與對照組相比較，橄欖苦苷組細胞內SOD及GSH-PX的活性明顯增加(P<0.01,P<0.05)，差異具有統計學意義。

2.4 Western blot檢測Caspase-3、Cyt-C表達

結果見圖1。與空白對照組比較，模型組Caspase-3、Cyt-C表達增加(P<0.01,P<0.05)，差異均具有統計學意義。與模型組比較，給予不同濃度的橄欖苦苷作用 48 h 后Caspase-3、Cyt-C表達顯著降低(P<0.01，P<0.05)，差異均具有統計學意義。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01圖1 橄欖苦苷對Caspase-3 、Cyt-C表達的影響

3 討論

在腦缺血疾病發生發展過程中，氧化應激損傷和抗氧化保護是研究的熱點。正常的生理狀態下存在著氧化應激平衡，當發生缺血再灌注(I/R)損傷時可破壞此平衡狀態，導致神經細胞壞死、凋亡，造成病理的損傷。研究表明活性氧(H2O2)是氧化應激過程中促使細胞凋亡的重要因素，因此常用于體外細胞氧化損傷實驗中[6]。本研究以H2O2誘導P12細胞制備氧化應激損傷的模型，用以從細胞水平研究橄欖苦苷抗H2O2誘導的PC12細胞凋亡的作用。

橄欖苦苷是從橄欖樹中提取的主要酚類成分，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤及心血管保護作用、防治骨質疏松、降血糖等作用[7-8]。研究者發現橄欖苦苷可能通過降低大腦神經細胞凋亡、降低Bax、提高Bcl-2的表達發揮神經保護作用[9]，或通過增加大腦抗氧化能力、ATP酶和端粒酶活性等作用機制產生抗阿爾茨海默病的作用[1]。橄欖苦苷對I/R損傷有一定的保護作用。徐濤等[4]通過構建HK-2細胞缺糖缺氧損傷模型，發現10、50、100、200 μmol/L的橄欖苦苷能夠提高HK-2細胞在缺糖缺氧環境下細胞的存活率，減輕由于缺糖缺氧引起的細胞凋亡。本研究結果表明，50～400 μmol/L的橄欖苦苷能夠明顯抑制H2O2的誘導PC12細胞活力的下降，本研究海發現橄欖苦苷的濃度達400 μmol/L時才引起P12細胞存活率的下降，這與徐濤等[4]的研究有差異。這可能與所用細胞株的狀態、所構建的細胞模型及橄欖苦苷的實際濃度有關。

腦血管I/R損傷時神經細胞出現壞死和凋亡兩種死亡形式，因此抑制神經細胞凋亡具有重要的意義。最近文獻表明人參皂苷Rg1能夠在細胞水平通過抑制細胞凋亡以及抗氧化途徑改善岡田酸誘導的PC12細胞損傷，發揮細胞保護作用[10]。本研究結果表明，不同濃度的橄欖苦苷能夠明顯抑制H2O2的誘導PC12細胞的凋亡，并具有時間/劑量依賴性，提示橄欖苦苷通過降低凋亡率對抗H2O2誘導的PC12氧化應激損傷。

超氧化物歧化酶(SOD)可以清除機體內的自由基，保護細胞不受強毒性氧自由基的損傷。文獻表明，SOD類似物可以通過清除氧自由基來發揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[11]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)廣泛存在于機體內，能夠促進過氧化物(例如H2O2)的分解，避免細胞膜結構和功能遭到過氧化物損害，為機體抗過氧化能力指標之一。本研究發現H2O2誘導的PC12細胞內SOD及GSH-PX活力明顯降低，橄欖苦苷則能夠抑制這一作用。

目前普遍認為I/R損傷過程中細胞內氧自由基是導致細胞線粒體損傷主要原因[12]。氧化應激能夠造成線粒體內膜產生非特異性孔道，細胞色素C 從內膜脫落釋放到細胞質[13-14]，細胞質中的細胞色素C激活Caspase-9并最終激活凋亡程序的執行者Caspase-3是[15]。本研究通過發現， H2O2誘導的PC12細胞胞內Caspase-3、Cyt-C蛋白表達增加，給予橄欖苦苷作用 48 h 后Caspase-3、Cyt-C表達顯著降低，提示橄欖苦苷通過抑制Caspase-3、Cyt-C表達發揮抗凋亡作用，從而對氧化應激損傷的細胞發揮保護作用。

總之，橄欖苦苷能夠通過增加H2O2誘導的PC12細胞內SOD及GSH-PX水平、抑制Cyt-C、caspase-3的釋放從而抑制H2O2誘導的PC12細胞的凋亡，最終減少氧化應激作用造成的細胞損傷，發揮細胞保護作用。