植物促生菌DM在脅迫條件下產多胺成分的變化

劉 秀，鄭宜令，李艷秋，范亞軍

（長春師范大學生命科學學院，長春 130032）

多胺作為一類帶正電荷的小分子脂肪族化合物，廣泛存在于原核生物與真核生物體內，在微生物細胞中多胺參與細菌的增殖與分化，維持細胞膜及核酸的穩(wěn)定性［1］。在酸性條件下，多胺通過控制轉錄與翻譯過程誘導細菌產生精氨酸脫羧酶（adiA）、鳥氨酸脫羧酶（speF）和賴氨酸脫羧酶（cadA），并進一步誘導產生多胺以適應酸性條件［2，3］。 Tkachenko 等［4］的研究結果表明，多胺可以通過上調rpoS、rmf、yqjD基因的表達促進抗生素條件下休眠細胞的形成，促使細菌產生抗藥性，可見多胺參與細菌的多種應激過程。

在高等植物體內，多胺在多個方面參與植物的生長過程［5-7］。 Ahmed 等［8］通過轉基因技術研究表明，過表達多胺轉運基因OsPUT1的擬南芥與野生型相比延遲開花16 d，而多胺轉運put5基因突變株比野生型提前開花4 d，表明多胺在影響植物生長發(fā)育及形態(tài)建成方面具有非常重要的作用。不僅如此，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多胺參與植物非生物脅迫條件下的抗逆調節(jié)，外源多胺能夠降低干旱、澇害、鹽脅迫等對植物造成的傷害［9-13］。

在前期研究工作中，作者所在項目組利用精氨酸為惟一氮源從羊草根際土壤中篩選出一株對植物具有促生作用的陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）菌株DM，促生試驗結果表明該菌能夠顯著提高西紅柿苗在NaCl脅迫條件下的抗逆能力，結合外源多胺與植物抗逆關系的報道，項目組推測陰溝腸桿菌菌株DM在脅迫條件下產生的多胺成分發(fā)生變化，進而影響植物逆境條件下的生長發(fā)育。本研究對不同脅迫條件下該菌產多胺成分進行了初步分析，為進一步明確其促生作用機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 所用植物促生菌為陰溝腸桿菌菌株DM，由作者所在實驗室篩選、鑒定并保存。

1.1.2 試劑 試驗所用腐胺、亞精胺、精胺標準品均購自Solarbio科技有限公司；苯甲酰氯購自Aladdin試劑公司；乙腈、甲醇購自美國Fisher公司；乙醚購自北京精細化學品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①ADF液體培養(yǎng)基。KH2PO44 g，Na2HPO46 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 2 g，葡萄糖酸 2 g，檸檬酸 2 g，精氨酸 2 g，pH 7.2，定容至 1 L，高壓滅菌后備用。②ADF固體培養(yǎng)基。ADF液體培養(yǎng)基1 L加入15 g瓊脂粉，高壓滅菌后備用。③含不同NaCl濃度ADF培養(yǎng)基。取等體積ADF培養(yǎng)基，加入不同質量 NaCl， 使其終濃度分別為 50、100、150、200、250、300 mmol／L，高壓滅菌后備用。 ④不同 pH的ADF培養(yǎng)基。取等體積ADF培養(yǎng)基，分別調節(jié)pH 至 5、6、7、8、9、10，高壓滅菌后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 從-70℃冰箱取出凍存菌種，在ADF固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落于10 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。吸取等量菌液接種于不同pH及不同NaCl濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（每個梯度重復5次）12～16 h。吸取菌液100 μL加入96孔板，利用酶標儀測定吸光度OD600nm（每個梯度重復3次）。

1.2.2 多胺衍生 DM菌體10 000×g離心5 min，收集上清液，將上清液于-70℃冰箱中過夜冷凍。用冷凍真空干燥儀冷凍72 h，將樣品凍干，用5 mL去離子水溶解凍存液，取2 mL進行衍生試驗。2 mL樣品置于10 mL離心管中加入1 mL氫氧化鈉（2 mol／L）、20 μL苯甲酰氯，漩渦混勻30 s，置于37℃水浴20 min，中間每隔5 min振蕩30 s。衍生完畢后加入1 g氯化鈉，2 mL乙醚，漩渦振蕩混勻30 s靜置，溶液分層后將乙醚層移至5 mL離心管中，用氮氣吹干。加入1 mL甲醇溶解，用濾膜抽濾，作為液相色譜分析上樣。

1.2.3 多胺標準品的衍生及萃取 準確稱取腐胺、亞精胺及精胺分別配制各樣品1 mg／mL儲備液，稀釋各儲備液至0.1 mg／mL工作液。將稀釋后的工作液進行衍生和萃取，吹干后加入1 mL甲醇溶解，用濾膜抽濾后備用。

1.2.4 高效液相色譜檢測標準品及樣品 柱溫為室溫；流動相為 A（乙腈）、B（H2O），檢測波長為 254 nm；進樣量為 10 μL。

2 結果與分析

2.1 不同NaCl濃度對DM菌體濃度的影響

等體積不同NaCl濃度ADF培養(yǎng)基接種相同體積的DM菌液，每個NaCl濃度重復5次，培養(yǎng)12～16 h后測定菌體OD600nm。 結果（圖1）表明，加入NaCl后 OD600nm下降，NaCl 濃度在小于 200 mmol／L時菌體OD600nm變化不大；NaCl濃度高于200 mmol／L時，OD600nm明顯下降。

圖1 不同NaCl濃度對DM菌體濃度的影響

2.2 不同pH對DM菌體濃度的影響

等體積不同pH的ADF培養(yǎng)基接種相同體積的DM菌液，每個pH重復5次，培養(yǎng)12～16 h后測定菌體OD600nm。結果（圖2）表明，DM菌在pH 7時菌體濃度最高，在酸性及堿性條件下菌體生物量下降。

2.3 不同NaCl濃度對DM菌產多胺的影響

菌體離心后將上清液凍干，按常規(guī)方法進行衍生及萃取，甲醇溶解后進行液相色譜分析。結果（圖3）表明，DM促生菌在對照組中（NaCl濃度為0）可檢出腐胺、亞精胺及精胺，其中以亞精胺含量較高，菌液中腐胺、亞精胺含量隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的升高而增加；結合定量分析結果可知，NaCl濃度為150 mmol／L時多胺濃度達到高峰值，隨后下降。

圖2 不同pH對DM菌體濃度的影響

2.4 不同pH對DM菌產多胺的影響

高效液相色譜檢測不同pH條件下DM菌產多胺成分的變化，通過與標準品對比，pH 5的培養(yǎng)液上樣10 μL幾乎不能檢出腐胺，但可檢出亞精胺和精胺；pH 6、7的培養(yǎng)液中可檢出3種多胺，pH 8時亞精胺和腐胺含量達到高峰，隨后開始下降（圖4）。

圖3 液相色譜檢測不同NaCl濃度條件下DM菌產多胺成分變化

3 討論

圖4 液相色譜檢測不同pH條件下DM菌產多胺成分變化

近年的研究表明，多胺參與植物非生物脅迫條件下的抗逆調節(jié)，其通過與多胺轉運體共同決定植物體內多胺的穩(wěn)態(tài)，并進一步激活或抑制基因表達調節(jié)植物的生長發(fā)育［7］。體外噴施亞精胺能抑制水脅迫下膜透性的增加［9］；腐胺可以降低鎘金屬脅迫對植物的損傷，同時腐胺可能參與協(xié)調植物螯合肽的生物合成來參與植物的應激反應［10］。另外多胺能夠清除植物體內氧自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化物酶（POD）活性，降低膜脂過氧化作用，減緩葉片衰老，抵御干旱及鹽脅迫，提高番茄高溫脅迫下花粉萌發(fā)率［12，13］。 本研究所用植物促生菌為陰溝腸桿菌菌株DM，前期的研究表明該菌在鹽脅迫條件下具有明顯的促生作用（尚未發(fā)表），為了進一步明確該菌的促生機制，本研究利用高效液相色譜對不同脅迫條件下該菌產多胺成分進行了初步分析，在NaCl脅迫下，培養(yǎng)液中NaCl濃度影響DM菌生物量，隨著NaCl濃度升高，菌液中腐胺、亞精胺、精胺濃度升高，在150 mmol／L NaCl培養(yǎng)液中3種多胺濃度均最大，之后多胺濃度隨NaCl濃度升高而降低。在酸性（pH 5、6）培養(yǎng)液中多胺含量明顯低于中性培養(yǎng)基，但在pH 8培養(yǎng)液中腐胺、亞精胺濃度最高，隨后降低。結合DM菌在鹽脅迫條件下的促生作用，其促生機制可能由于DM菌在鹽脅迫條件下進行應激反應而產生3種多胺，所產生的多胺作為外源多胺進一步作用于植物，影響植物的生長發(fā)育，但其確切的分子機制，如多胺轉運酶的變化，DM菌在脅迫條件下與多胺合成相關的機制需要進一步研究。