草莓抗枯萎病分子標記初定位

史芳芳

（新疆生產建設兵團第十二師農業科學研究所，烏魯木齊 830088）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是具有較高經濟價值的重要漿果之一，隨著草莓設施栽培產業的發展，草莓連作病害日趨嚴重。草莓枯萎病就是連作病害中的主要病害之一，可導致草莓產量和品質的大幅度降低，嚴重危及草莓產業的發展。草莓枯萎病是由尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum f.sp.fragariae）寄生引起的一種真菌土傳病害，通過侵染根部在維管束內蔓延，然后堵塞其導管并分泌有毒物質，最后造成葉片萎蔫直至植株枯萎死亡［1］。病菌通過種苗、土壤、灌溉水和農具等方式傳播，可在苗期或開花至收獲期發病，植株一旦發病會造成結果減少，果實不能正常膨大，品質變劣，產量大幅度降低等，嚴重影響草莓產業的發展［2，3］。 近年來，隨著國內草莓設施栽培面積的不斷擴大，草莓枯萎病在中國的一些主要種植區均有發生，危害也有逐年加重的趨勢［4］。

目前，國內外對枯萎病等真菌病害的防治主要依賴于化學藥劑，這無疑會給廣大消費者的食品安全帶來威脅，而且常常防治效果不佳。另一方面，長期大量使用農藥會對環境造成不良影響。改變這種不利局面的最直接、經濟有效的措施就是培育抗枯萎病草莓新品種。定位相關的抗病基因是培育草莓抗病新品種的基礎，在番茄、西瓜、棉花、黃瓜等農作物中有枯萎病相關抗性基因定位的報道，對草莓抗性基因研究較多的主要有草莓白粉病、灰霉病、炭疽病等抗病基因［5-8］，而目前對于草莓枯萎病抗性基因的遺傳特性及其相關基因分子標記的研究仍較少。為此，試驗在前人對草莓中SSR分子標記的研究基礎上，對草莓抗枯萎病的相關基因進行初步定位，期望能夠找到與抗病基因緊密連鎖的分子標記，為未來的分子標記輔助育種，篩選優良抗病品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中草莓親本紅顏、甜查理、紫金四季、寧玉、紫金香玉、章姬由新疆生產建設兵團第十二師農業科學研究所草莓種苗繁育基地提供，后代優系由江蘇省農業科學院提供。抗病鑒定所用草莓枯萎病病原菌經形態學和分子生物學鑒定分析為鐮刀菌。親本及優系后代均種植于新疆生產建設兵團第十二師農業科學研究所育苗網室冷棚。

1.2 方法

1.2.1 苗期枯萎病抗性分析 按照文獻［9］中抗病性鑒定方法，采用苗期人工灌根接種鑒定法和葉片離體培養法。試驗接種所用病原菌分離自草莓感病根部，樣本采自新疆生產建設兵團第十二師農業科學研究所草莓育苗基地有典型癥狀的感病植株，結合形態學鑒定和柯赫法則驗證為草莓枯萎病病原菌。

于草莓子苗有3片完全展開葉片時采用灌根法，慢慢灌根接種，每一營養缽接種孢子懸浮液50 mL。接種后在25℃、高濕環境條件下培養。每一株系重復4次，每重復5株，計20株。接種后12～15 d進行調查，根據植株感病癥狀對病株進行病情分級。按感病葉片數占調查總葉片數的百分率分感病等級。感病等級劃分為0～6級（圖1），等級0、1、2、3 級劃為抗病類型， 等級 4、5、6 級劃為感病類型。

圖1 枯萎病抗性鑒定等級

1.2.2 抗病基因的獲得 參考草莓抗病基因相關文獻，合成抗病相關基因引物NBS-1F：5′-CCCCCTCA ACACCTTTCCTTTTCT-3′，NBS-1R：5′-CAATCCCTG CGAGACAGAGATGAA-3′。提取父本、母本及后代優系DNA，采用25 μL PCR擴增反應體系，其中包括 1μL（約 50ng）模板 DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含 Mg2+）、0.4 μmol／L 引物（上、下引物各 1 μL）、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL、ddH2O 9.1 μL。 PCR 反應程序：94℃預變性 4 min；94℃變性 30 s，55℃退火45s，72℃延伸 1min，35個循環；最后72℃延伸5min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證能否擴增出抗病全長基因。

1.2.3 SSR標記分析 試驗選取20對薔薇科SSR引物，引物序列參考已發表的文獻［7，8］，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。采用25 μL PCR 擴增反應體系，其中包括 1 μL（約 50 ng）模板DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含 Mg2+）、0.4 μmol／L引物（上、下引物各 1 μL）、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL、ddH2O 9.1 μL。

1.2.4 多態性分子標記篩選 20對引物以親本為模板，篩選出兩親本之間表現多態性的引物，再對8個后代優系進行分析。在后代產生差異且在兩親本間（高抗和高感親本）也存在差異條帶的引物組合即初步認為是與抗枯萎病基因連鎖的SSR分子標記。

2 結果與分析

2.1 抗病性鑒定與遺傳分析

采用人工灌根法和葉片培養法進行抗病試驗，調查枯萎病的發病情況，結果見表1。灌根法和葉片培養法試驗顯示，后代13-52-407和13-53-100具有很強的枯萎病抗性，抗性較強的兩個后代的親本均為章姬和甜查理，這可能遺傳了親本甜查理抗病性較強的特性，而13-65-265抗病性較差，其親本為紫金香玉與紅顏，可能后代遺傳了親本紅顏抗病性較差的特性，抗病性表現如圖2和圖3所示。

2.2 抗病基因NBS的擴增結果

通過NBS引物首先對親本進行PCR擴增，擴增產物凝膠電泳結果顯示，紫金四季和甜查理擴增獲得一條約2 500 bp的特異條帶，對此擴增產物進行測序分析，測序結果表明NBS全長2 434 bp，基因組 DNA 包括 3 個外顯子，依次長 629、780、682 bp，2個內含子分別長240 bp和103 bp。接著對父本和母本為紫金四季和甜查理的優系進行后代抗病性遺傳分析，優系13-53-100、13-52-407也擴增到此條帶，如圖4所示。結果表明抗病性基因篩選結果與“2.1”的抗病性試驗結果一致。

表1 親本及后代材料抗感鑒定結果

圖2 葉片抗病性試驗

圖3 灌根法抗病性試驗

2.3 STR微衛星分析

用20對引物對父本和母本進行分析，結果顯示其中10對引物表現出多態性，分別為引物FSS6、FSS8、FSS50、FSS61、FSS65、FSS121、FSS128、FSS139、FSS143、UFFxa01H05，具體見表2。將這些篩選出的10對引物再對其優系后代進行分析，其中引物FSS121在后代13-52-407中擴增出與母本甜查理一致的多態性條帶，條帶大小為193 bp和202 bp，其他引物擴增出雜合帶，即出現與父本和母本不一致的條帶。通過微衛星分析初步判斷，后代13-52-407遺傳了親本甜查理的抗病性（圖5）。

圖4 抗病性基因擴增結果

表2 SSR引物序列

3 小結

草莓抗病育種已經成為國內國際草莓育種人的育種目標之一，抗病性篩選的方法最初為人工噴霧和灌根等方法，最近幾年利用抗病基因和抗病分子標記篩選成為抗病性鑒定的主要手段。通過分子輔助育種能夠快速培育出持久抗性品種，該方法是加快草莓育種和提高育種水平的措施之一。國內對草莓抗病相關分子標記及抗病基因的研究主要集中在草莓白粉病［7，10］、灰霉病［6，8］及炭疽病［11］等病害上，鮮有關于枯萎病抗病性鑒定的研究，所以本研究對于草莓抗枯萎病的研究具有重要的參考價值。

本研究通過人工抗病試驗篩選，結合抗病基因檢測，初步確定了草莓優系后代13-52-407和13-53-100具有較強的抗病性，驗證了篩選出的這2個優系遺傳了親本甜查理的抗病性，這與其他對于高抗 親本甜查理 的研究一致［6-8，10，11］，充分 證 明了甜查理可作為草莓抗病育種的首選高抗親本。分子標記（微衛星）分析結果只顯示優系后代13-52-407遺傳了親本甜查理的抗性，而未顯示13-53-100的抗性標記，這可能與分子標記引物篩選范圍不廣泛有關，后續將繼續開展此項工作。對于其他甜查理作為親本的后代優系沒有發現明顯的抗病性，分析原因可能是因為孟德爾規律，性狀在后代發生了分離。

圖5 分子標記引物FSS121擴增甜查理（a）和子代13-52-407（b）的結果