人防御素HD-5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究

尚曉宇 顧國威 柳國權(quán) 齊靖 解強 李坤

2018年中國胃癌新發(fā)病例45.6萬人，占所有新發(fā)腫瘤病例的10.6%，僅次于肺癌，排名第2位[1，2]。目前針對胃癌治療仍然缺少有效手段，其5年生存率不足50%，嚴重威脅我國人民的健康[1-3]。

防御素是普遍存在的一類帶有正電荷的小分子多肽，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用[4]。在哺乳動物細胞中主要由特定的白細胞和上皮細胞表達分泌。人防御素根據(jù)結(jié)構(gòu)和分泌細胞的不同分為α和β兩個家族，其中α-防御素包括人中性粒細胞防御肽1-4（Human neutrophil peptide，HNP1-4），人防御素5和6（humandefensin5and6，HD-5，HD-6），β-防御素（human β defensin，HBD）包括HBD1-6[5-7]。在不同的腫瘤組織中已經(jīng)觀察到防御素的異常表達，例如HNP1-3在包括肺癌、腎癌、膀胱癌、T細胞淋巴瘤等不同的腫瘤組織中高表達；HD-6 在結(jié)腸癌組織中高表達[8，9]。而HBD-1在包括前列腺癌、腎癌、結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中低表達，在腫瘤發(fā)生過程中行使腫瘤抑制因子功能[9]。此外，防御素的異常表達與腫瘤免疫密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在某些類型的腫瘤中，防御素表達缺失與腫瘤浸潤減少具有相關(guān)性，表達HBD2的溶瘤病毒能夠募集更多的免疫細胞到腫瘤部位，從而增強腫瘤抑制效果[10]。筆者前期檢索The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn) α-防御素家族成員HD-5在胃癌中表達量較癌旁組織顯著降低。目前其低表達與免疫細胞的浸潤減少存在相關(guān)性，且防御素在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少。因此本研究通過免疫組化、實時熒光定量PCR、細胞遷移、裸鼠成瘤等手段初步探討HD-5的表達與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為胃癌的治療提供分子生物學(xué)依據(jù)，并指導(dǎo)胃癌治療的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚腎細胞HEK293T和人胃腺癌細胞AGS購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基（Gibco，C11965500BT）、RPMI1640培養(yǎng)基（貨號：C11875500BT）、胎牛血清（貨號：10099-141）、青鏈霉素（貨號：15070063）、谷氨酰胺（貨號：15140-122）、CCK8細胞增殖檢測試劑盒（貨號：C35006）、RIPA裂解液（貨號：R0278）、抗HA抗體（貨號：26183）、Trizol（貨號：15596018）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：K1651）均購自美國Thermofisher公司。Transwell小室（貨號：3422）購自美國康寧公司。抗β-actin（貨號：A1978）抗體購自美國Sigma公司。SPF級BALB/c裸鼠（雌性，6-8周齡）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 人腫瘤樣品的采集

篩選廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的胃腺癌患者24例，手術(shù)切除胃癌組織樣本和距離癌組織3～5厘米處的癌旁組織，立即放于組織凍存液中，液氮速凍后置于-80℃條件下存儲。本研究腫瘤樣本的使用已得到醫(yī)院人類研究倫理委員會（番醫(yī)倫審批[2019]36號）批準(zhǔn)，所有參與者均知情并同意。

1.3 熒光定量PCR

Trizol法提取癌組織和癌旁組織中的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 引物序列如下：GAPDH：正義，5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′；反 義 ，5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′；HD5：正義，5′-CCTCAGGTTCTCAGGCAAGA-3′；反義，5′-GGCCACTGATTTCACACACC-3′。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，60℃退火 20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)；72℃終延伸5 min，進行熔解曲線分析以確認產(chǎn)物的特異性，4℃維持至結(jié)束。GAPDH作為正常化的內(nèi)部對照，用2ΔΔCt法計算分析基因的相對表達水平。

1.4 免疫組化

石蠟包埋組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫蠟及梯度酒精水處理。利用羅氏Ventana自動免疫組化儀進行抗原修復(fù)、HD-5抗體標(biāo)記及DAB染色。經(jīng)脫水、透明、封片后，鏡檢觀察。

1.5 細胞培養(yǎng)

HEK293T在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，AGS在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均補充有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，將細胞培養(yǎng)在有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中。

1.6 HD-5穩(wěn)定表達細胞系的構(gòu)建及檢測

克隆人HD-5的蛋白質(zhì)編碼序列到慢病毒載體PCDH上，將上述構(gòu)建好的慢病毒載體連同包裝質(zhì)粒（psPAX和PMD2.G）共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液過濾后侵染AGS細胞，48 h后加入嘌呤霉素篩選得到HD-5穩(wěn)定表達細胞系。收集細胞，用免疫印跡法檢測外源蛋白表達。

1.7 CCK8檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期且穩(wěn)定表達HA-Vec和HA-HD-5的AGS細胞接種于96孔板中，每孔接種5 000個細胞，將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)置5個平行。分別于1、2、3、4 d后于每孔中加入CCK8溶液（每孔100 μL加入10 μL）。以加入相應(yīng)量的細胞培養(yǎng)物和CCK8，但未加入細胞的孔作為空白對照。在37度孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值（OD）。

1.8 Transwell細胞遷移實驗

將Transwell小室置于24孔板中，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640高糖培養(yǎng)基。將穩(wěn)定表達HA-vec和HA-HD-5的AGS細胞以每孔1×105個接種于Transwell小室的上室。培養(yǎng)24 h后，取出各組小室，用棉簽沾取PBS后輕輕擦拭小室膜的上層以去除未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛固定及0.1%結(jié)晶紫染色，于100倍正置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照計數(shù)。

1.9 裸鼠成瘤實驗

將無血清培養(yǎng)基混懸的腫瘤細胞懸液0.1 mL（含細胞數(shù)1.0×107，50%Matrigel）注射于每只小鼠左右兩側(cè)腋下皮下部位。腫瘤細胞接種后，以游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑L和短徑W，計算腫瘤體積（Tumor Volume，TV），計算公式為：TV=0.5×L×W2。實驗結(jié)束時，分離腫瘤組織并用數(shù)碼相機進行拍照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS 15.0軟件對各比較組進行T檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。*P＜0.05差異時有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR檢測胃癌組織中HD-5表達

使用實時熒光定量PCR對手術(shù)切除的胃癌組織和癌旁組織樣本進行檢測，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中HD-5蛋白的表達水平顯著降低，平均含量僅為癌旁組織的50%（癌組織：1.583+0.176 6，N=24，癌旁組織：3.613+0.184 8，N=24），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 免疫組化檢測胃癌組織中的HD-5蛋白表達

通過免疫組化技術(shù)檢測手術(shù)切除的胃癌組織和癌旁組織中HD-5蛋白的表達變化，檢測結(jié)果顯示HD-5蛋白在癌組織中的表達顯著低于癌旁組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 免疫組化檢測HD-5在癌組織和癌旁組織中的表達Figure1 Immunohistochemical detection of HD-5 in cancerous and adjacent tissue

2.3 HD-5過表達對胃癌細胞系構(gòu)建

在胃癌細胞系A(chǔ)GS中通過轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達HD-5構(gòu)建穩(wěn)定高表達細胞系，免疫印跡檢測確定外源轉(zhuǎn)染的HD-5基因在AGS細胞中穩(wěn)定高表達。見圖2。

圖2 免疫印跡檢測在AGS細胞中過表達的外源HD-5Figure2 Western blot detection of exogenous HD-5 expression

2.4 HD-5過表達抑制胃癌細胞增殖

采用CCK8方法檢測細胞增殖能力，結(jié)果顯示HD-5過表達能夠抑制胃癌細胞AGS的增殖能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 HD-5過表達抑制胃癌細胞遷移

HD-5過表達能夠抑制AGS細胞系的遷移能力，HD-5過表達組平均每個視野遷移細胞數(shù)目比對照組少約30個細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖3 CCK8檢測高表達HD-5的AGS細胞的增殖能力Figure3 CCK8 detection of HD-5 overexpressed AGS cell proliferation

圖4 對照細胞和HD-5高表達AGS細胞的遷移能力比較Figure4 Comparison of cell migration between control and HD-5 overexpressed AGS cell

2.6 HD-5對裸鼠成瘤的影響

實驗結(jié)果顯示，與對照細胞相比，HD-5高表達的AGS細胞在裸鼠體內(nèi)生長速度明顯變慢，第20天腫瘤體積約為500 mm3，僅為對照組體積的四分之一，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 HD-5過表達抑制AGS細胞在裸鼠皮下的生長速度（*P＜0.05）Figure5 Comparison of tumor growth by xenograft model（*P＜0.05）

3 討論

近年來腫瘤的治療進展迅速，但針對胃癌靶向治療藥物的研發(fā)進程緩慢，其主要原因為胃癌的發(fā)生發(fā)展機制不明確。目前臨床主要采用手術(shù)切除結(jié)合放化療的標(biāo)準(zhǔn)療法[3，11]。防御素作為廣泛參與生物體的先天免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵分子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤免疫密切相關(guān)[6]。2001年，劉文超等人研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞中提取的防御素對胃癌細胞具有良好的殺傷作用，但該研究并未明確防御素的種類[14]。2005年，Nomura等首次發(fā)現(xiàn)HD-5在部分胃癌細胞中表達缺失，提示其可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)系[12]。2013年，Inada等首次報道了HD-5有可能通過下調(diào)E-cadherin表達抑制食管鱗癌細胞的生長，明確HD-5可能行使類似腫瘤抑制因子的功能[13]。筆者通過腫瘤樣本的公開測序數(shù)據(jù)庫挖掘分析也發(fā)現(xiàn)，HD-5在胃癌組織中表達缺失，這與2005年Nomura等發(fā)現(xiàn)一致。基于此，筆者設(shè)計一系列體內(nèi)外實驗，以深入研究HD-5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的可能機制。

本研究中首次在臨床樣本中比較了人防御素HD-5在胃癌組織和癌旁組織中的表達差異，證實了HD-5在癌組織中低表達，對胃癌細胞的增殖、遷移、體內(nèi)裸鼠成瘤有抑制作用，是一個潛在的腫瘤抑制因子，其缺失與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，防御素可通過其細胞毒作用直接接觸破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，或者通過與細胞骨架蛋白結(jié)合誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[6，7]。此外，防御素除直接抑制腫瘤的細胞增殖外，還能通過募集免疫細胞改變腫瘤的免疫微環(huán)境，進而抑制腫瘤的生長，例如樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）等[6，14]。HD-5在胃癌組織中缺失很有可能導(dǎo)致抑制性腫瘤免疫微環(huán)境的改變，進而導(dǎo)致腫瘤的快速增殖。已有報道證實，防御肽腫瘤中的高表達能夠促進腫瘤內(nèi)部免疫細胞浸潤和腫瘤免疫治療的活性。因此，HD-5對胃癌的抑制作用，一方面可能通過細胞毒類效果抑制細胞增殖和遷移，另一方面也可能是通過改變腫瘤免疫微環(huán)境實現(xiàn)。本研究進行的采用免疫缺陷小鼠觀察到的腫瘤抑制效果也從體內(nèi)裸鼠成瘤實驗側(cè)面印證了HD-5的細胞毒類作用機制。本研究對HD-5在腫瘤免疫微環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用并未探討，未來研究中擬采用正常小鼠建立鼠源腫瘤模型，進一步驗證HD-5在腫瘤免疫中的作用，尤其是與現(xiàn)有的免疫檢查點抑制劑類藥物（如PD-1/PD-L1抗體藥物）、自然殺傷細胞（naturalkillercell，NK）和 CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy）等新型治療方法的相互作用機制。防御素能否增強這類藥物治療效果將是下一步研究重點。綜上，本研究首次證實了HD-5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為防御素參與腫瘤調(diào)控提供了初步證據(jù)，為改善胃癌的治療以及提高腫瘤免疫療法效果提供了依據(jù)。