SMARCC1基因對肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的調控作用

柯少波 石 薇 陳佳梅 邱 虎 陳永順

肝癌是全球最為常見的惡性腫瘤之一，在我國大多數患者是由肝硬化和慢性肝炎進一步發展而來[1]。手術治療仍是目前最為有效的治療手段，但復發率較高已經供肝缺乏[2]。肝癌的基因治療主要通過調控腫瘤細胞遺傳物質達到有效的抗腫瘤作用[3]。SMARCC1蛋白是染色體重塑復合體亞基的主要成員之一[4]，多項研究表明其參與了腫瘤的發生和發展[5-6]。本課題組前期研究發現，沉默SMARCC1能抑制乳腺癌細胞的生物學活性，抑制腫瘤的侵襲轉移[7]。本研究擬通過下調肝癌細胞SMARCC1基因，探討SMARCC1對乳腺癌增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞培養

肝癌細胞HepG2系購自武漢大學細胞典藏中心，低糖DMEM培養基、血清、胰蛋白酶等均購自武漢愛生源生物有限公司，Trizol和Lipofectamine2000為美國Invitrogen公司產品，SMARCC1-siRNA及其對照物購自廣州銳博生物公司，細胞培養瓶、培養板、MTT試劑、等耗材均購自武漢谷歌生物公司，凋亡試劑盒購自碧云天公司。

1.2 實驗分組與轉染

肝癌細胞HepG2采用低糖DMEM培養基(含有10%胎牛血清和1%雙抗)培養，置于37 ℃、5%二氧化碳及飽和濕度的恒溫培養箱中培養。為研究下調SMARCC1對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡和蛋白表達的影響，本實驗將細胞系分為兩組，SMARCC1下調組(轉染SMARCC1-siRNA)和 對照組(轉染siRNA陰性對照物)，將細胞置于六孔板中培養，當細胞融合程度達到70%左右時進行瞬時轉染，轉染操作按照廣州銳博公司產品說明書進行，轉染試劑采用Lipofectamine 2000，轉染最終濃度為50 nmol/L。

1.3 MTT檢測細胞增殖

轉染24小時后，將細胞以每孔3000個細胞接種于96孔板中，每孔細胞懸浮液的體積為100 μl，分為實驗組和對照組，每組設置5個復孔，并設置空白對照孔，培養24 h、48 h、72 h后采用MTT法檢測細胞增殖。MTT檢測方法概括為：在96孔板的每孔中加入10 μl的5 mg/L的MTT溶液， 37 ℃條件下放置下4 h后，棄掉培養基，每孔加入150 μl的DMSO溶液，孵育10 min，置于振蕩器上微震蕩15 min，使得甲瓚結晶充分溶解于DMSO中，采用酶標儀檢測各組的吸光度值(OD值)，通過空白對照孔調零。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測細胞凋亡：轉染48 h后，收集細胞約1×106個/ml，PBS洗滌一次、離心、棄上清，然后將細胞懸浮液重懸于1 ml孵育緩沖液中。取100 μl細胞(約1×105個)加5 μl的PI試劑和5 μl的AnnexinV-FITC試劑，置于室溫下避光孵育15 min。最后加400 μl的孵育緩沖液，一般在1 h內上流式細胞儀機檢測。FCM激發波長為488 nm，采用波長515 nm的通帶濾器檢測FITC的熒光，另一波長>560 nm的濾器檢測PI。

1.5 RT-PCR檢測mRNA表達

Trizol法提取細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度是否達標，然后按照TagMan RNA逆轉錄試劑盒(購自美國ABI公司)說明書進行逆轉錄，獲得cDNA。采用SYBR Green PCR master mix試劑盒(購自日本TAKARA公司)進行qRT-PCR。采用2-△△方法進行定量分析，以β-actin作為內參，計算caspase-3、Bcl-2，相對表達量。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白。配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，加樣，電泳，濃縮膠80 V電泳35 min，分離膠100 V電泳90 min，分離蛋白，注意設置marker蛋白。采用濕轉發進行轉膜，350 mA，轉膜120 min，將蛋白轉至PVDF膜上。然后進行免疫雜交操作。取出PVDF膜，用BSA封閉1小時，兔抗人一抗孵育過夜(4 ℃條件下)，caspase-3 抗體購自武漢三鷹公司，稀釋比為1∶1 000，Bcl-2一抗購自Abcam公司，抗體稀釋比為1∶1 000，Actin一抗購自三鷹公司抗體稀釋比為1∶3 000；TBST系膜3次，每次5 min，二抗(山羊抗兔)孵育1 h，二抗為HRP標記山羊抗兔 IgG，購自三鷹公司，抗體稀釋比為1∶5 000，TBST洗膜，每次5 min，化學發光法顯影，在暗室中進行曝光操作，掃描膠片上蛋白條帶并用軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 下調SMARCC1對HepG2細胞增殖及凋亡作用

MTT實驗結果表明，轉染后24 h，48 h和72 h SMARCC1下調組的HepG2細胞增殖均低于對照組(P<0.05)，且隨著時間增加，SMARCC1下調組的MC F-7細胞增殖被抑制程度越大，具有時間依賴性，見圖1。Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡結果表明，SMARCC1下調組晚期凋亡率(7.3±0.9)%高于對照組晚期凋亡率(1.3±0.1)%，P<0.01。

2.2 兩組細胞Caspase-3、Bcl-2 的mRNA表達水平比較

RT-PCR實驗結果表明，實驗組 Caspase-3的mRNA相對表達量高于對照組，實驗組Bcl-2mRNA相對表達量低于對照組，均差異有統計學意義。見表1。

圖1 MTT實驗結果

組別Caspase-3Bcl-2對照組0.257±0.0680.724±0.055實驗組0.452±0.0760.306±0.072t8.3659.749P<0.01<0.01

2.3 兩組細胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達水平比較

Western blotting實驗結果表明，實驗組 Caspase-3蛋白表達相對灰度值比高于對照組，實驗組Bcl-2蛋白表達相對灰度值比低于對照組，差異均有統計學意義，見表2和圖2。

表2 兩組細胞Caspase-3、Bcl-2蛋白灰度值比較

圖2 兩組細胞蛋白條帶圖

3 討論

核小體染色質重塑復合體主要通過改變染色質空間結構而調控其疏松程度，從而調控下游基因的轉錄表達和細胞表型等過程，是表觀遺傳學的重要機制之一[8-9]。SWI/SNF復合體及其介導的核小體染色質重塑已經是腫瘤研究的焦點，SWI/SNF亞基基因在卵巢癌[10]、胃癌[11]、肝細胞癌[12]、膀胱癌[13]、腎癌[14]、乳腺癌等腫瘤中高度突變，參與了腫瘤發生、發展，可能是1種普遍癌癥發生機制。SWI/SNF復合體的核心亞基之一SNF5在人和小鼠中表現為一種抑癌基因，SNF5在肝癌組織中表達低于癌旁組織，其表達量與肝癌細胞分化程度有關，SNF5在肝細胞肝癌中呈現為低表達，并且其低表達與肝細胞肝癌的低分化程度顯著相關。SMARCC1是SWI/SNF復合體的亞基之一，本研究下調肝癌細胞系的SMARCC1基因，MTT和凋亡實驗結果表明，下調SMARCC1抑制了肝癌細胞的增殖，促進其凋亡。研究表明SMARCC1在乳腺癌、前列腺癌等中均呈現高表達，且細胞實驗表明內源性的高表達促進了腫瘤細胞的增殖和侵襲，因此，SMARCC1可能是1種癌基因[15]。 另有研究者表明，SMARCC1在前列腺癌組織中呈現高表達，SMARCC1的表達高低與前列腺癌復發、淋巴轉移及病理Gleason分級呈正相關[16]。

為進一步探討下調SMARCC1而促進肝癌細胞HepG2凋亡的機制，本研究采用RT-PCR法及Western blotting 法檢測實驗組和對照組細胞增殖相關基因caspase-3和Bcl-2基因的蛋白和mRNA表達水平變化，結果表明，SMARCC1下調組細胞caspase-3的蛋白和mRNA表達水平均高于對照組，而SMARCC1下調組細胞Bcl-2的蛋白和mRNA表達水平均低于對照組。Caspase-3是caspase家族的重要成員之一，是1種蛋白酶，活化的caspase-3能促進腫瘤細胞凋亡，在惡性腫瘤細胞凋亡中起著不可替代的作用。caspase-3參與腫瘤細胞凋亡機制之一主要是誘導CTL細胞殺傷，本研究SMARCC1下調組的肝癌細胞caspase-3表達增加，說明下調SMARCC1后可能通過上調caspase-3基因表達而促進肝癌細胞的凋亡。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)同樣是細胞凋亡研究中最受關注的基因之一，Bcl-2是重要的癌基因，能夠與其家族的Bcl-X1、Bcl-Xs、Bax等結合，形成同源的蛋白二聚體，抑制腫瘤細胞凋亡。在Bcl-2與Bax形成的二聚體中，如果Bax相對量高于Bcl-2，則促進腫瘤細胞凋亡，而Bcl-2若高于Bax則抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進腫瘤發生發展。本實驗中下調SMARCC1后Bcl-2基因表達水平被抑制，說明下調SMARCC1基因可能通過抑制癌基因Bcl-2而抑制腫瘤細胞增殖活性。

總之，下調SMARCC1基因能抑制腫瘤細胞增殖活性，促進其凋亡，其機制可能與活化caspase-3蛋白及抑制癌基因Bcl-2等通路相關。