血漿miRNA-200b及miRNA-21在漿液性卵巢癌中的表達特點分析

郝文濤 楊亞玲 張海雁

卵巢癌是當前婦科惡性腫瘤患者死亡的主要原因，由于在早期缺少典型的癥狀，被確診時大都處于腫瘤晚期，5年生存率維持在30%左右[1-2]。漿液性卵巢癌為具有惡性潛能的卵巢上皮性腫瘤，也是卵巢癌的常見類型，具有間質(zhì)細胞瘤特征，當前在我國的發(fā)病有逐年升高的趨勢[3]。當前對于漿液性卵巢癌缺乏早期有效的診斷方法，找到一種有效的早期生物學(xué)標志物是目前臨床研究的重點[4]。MircoRNAs(miRNAs)是長21～23 nt的非編碼短鏈RNA，通過堿基配對的方式作用于相應(yīng)靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA轉(zhuǎn)錄后抑制或降解[5-6]。miRNAs通過參與調(diào)節(jié)細胞分化、細胞增殖凋亡等多種途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[7-8]，特別是miRNAs可通過靶向誘導(dǎo)作用于轉(zhuǎn)錄因子和細胞信號傳導(dǎo)途徑系統(tǒng)中，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[9]。卵巢癌組織、患者血清及外周血小體中檢測到多種miRNAs的異常表達，其中表達有顯著變化的有miRNA-200b及miRNA-21、miR-125b、miR-140等[10-11]。本研究以不同患者的血清標本作為對象，探討了血漿miRNA-200b及miRNA-21在漿液性卵巢癌中的表達特點，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究時間為2013年8月到2017年12月，采用回顧性、總結(jié)研究方法，選擇在我院接受手術(shù)切除的漿液性卵巢癌患者60例作為卵巢癌組，同時選取同期患有良性上皮性卵巢腫瘤患者50例作為良性組，選擇具有正常卵巢組織的40例患者作為對照組。納入標準：臨床資料完整；所有患者術(shù)后均經(jīng)病理結(jié)果證實；所有標本在采集后進行液氮保存；術(shù)前均未接受放、化療及其他治療；患者在自愿條件下簽署了知情同意書；采集血清標本前都經(jīng)過中醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。排除標準：臨床資料缺項者；妊娠與哺乳期患者。

卵巢癌組患者年齡23～68歲，平均年齡(45.61±2.48)歲；平均病程(4.11±1.14)年；平均體重指數(shù)(21.48±2.77)kg/m2；臨床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例；組織學(xué)分化程度：高分化30例，中分化20例，低分化10例。良性組患者年齡22～70歲，平均年齡(44.21±3.19)歲；平均病程(1.89±0.29)年；平均體重指數(shù)(22.43±3.19)kg/m2。對照組患者年齡21～72歲，平均年齡(44.90±4.82)歲；平均體重指數(shù)(23.14±2.82)kg/m2。

3組年齡、體重指數(shù)對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 血漿miRNA-200b及miRNA-21檢測

取所有患者的全血樣本，低溫3 000 rpm/min離心10 min取血漿，每200 μl血漿樣本加入900 μl MZA裂解液，混勻到完全勻漿。室溫放置5 min后加入200 μl氯仿，劇烈振蕩15 s，低溫12 000 rpm/min 離心15 min；取水相，加入3倍體積的無水乙醇然后轉(zhuǎn)入吸附柱，12 000 rpm/min離心30 s；取吸附柱，加入700 μl去蛋白液MRD，12 000 rpm/min離心30 s；取吸附柱，加入漂洗液500 μl，2 000 rpm/min離心30 s；重復(fù)洗滌1次；取吸附柱，加入洗脫緩沖液50 μl,12 000 rpm/min離心30 s，取提取產(chǎn)物。提取的RNA的濃度測定及質(zhì)量鑒定，確保A260/A280>1.9。RNA樣本經(jīng)過加尾及反轉(zhuǎn)錄后進行定量real-time PCR，配成25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，實驗結(jié)果采用熒光定量PCR中的相對定量法進行分析，每個標本設(shè)3個平行管，重復(fù)3次。miRNA-200b正向引物：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，反向引物：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'；miRNA-21正向引物：5'-CGCGGCAAAGTCCGAGGTTAT-3'，反向引物：5'-CGCGGAAACGTTACCATTA-3'。

1.3 統(tǒng)計方法

本研究的計量數(shù)據(jù)與計數(shù)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.00軟件進行分析，采用均數(shù)±標準差、率等表示，行t或卡方檢驗，3組之間對比為Kruskall-Wallis檢驗，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21表達量對比

卵巢癌組中血漿miR-21相對表達量顯著高于良性組與對照組(P<0.05)，miR-21在良性組與對照組中的相對表達量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別例數(shù)ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt卵巢癌組6010.44±0.53?#-2.19±0.45?#4.85±1.24?#良性組5012.49±0.41-0.13±0.081.14±0.28對照組4012.63±0.43-0.09±0.021.09±0.14

注：#為與良性組對比，P<0.05；*為與對照組對比，P<0.05。

2.2 miRNA-200b表達量對比

卵巢癌組中血漿miRNA-200b相對表達量顯著高于良性組與對照組(P<0.05)，miRNA-200b在良性組與對照組中的相對表達量(2-ΔΔCt)對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別例數(shù)ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt卵巢癌組6011.02±0.53?#-3.22±0.46?#5.58±1.33?#良性組5014.20±1.22-0.22±0.091.32±0.43對照組4013.22±1.44-0.21±0.031.21±0.14

注：#為與良性組對比，P<0.05；*為與對照組對比，P<0.05。

2.3 miRNA-200b及miRNA-21表達與卵巢癌臨床特征的相關(guān)性

不同臨床分期、分化程度卵巢癌患者的miRNA-200b及miRNA-21表達量對比,差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 miRNA-200b及miRNA-21表達與卵巢癌臨床特征的相關(guān)性

注：*為與Ⅰ期或高分化對比，P<0.05；#為與Ⅱ期或中分化對比，P<0.05。

2.4 相關(guān)性分析

在卵巢癌患者中，線性相關(guān)分析顯示血漿miRNA-200b與miRNA-21表達量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(γ=0.562,P<0.05)。

3 討論

卵巢癌在我國發(fā)病率高，卵巢組織成分復(fù)雜，漿液性卵巢癌是比較常見的卵巢癌類型，約占原發(fā)性卵巢腫瘤的1/3[12]，其早期臨床癥狀隱匿，多數(shù)者無明顯臨床癥狀，在確診時多為晚期，因此患者預(yù)后生存率低，為此早期診斷卵巢癌是提高患者遠期生存率的有效途徑[13-14]。

miRNAs在多種腫瘤中均有表達，并在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。不同組織學(xué)類型的卵巢癌的miRNAs譜不同，漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌，透明細胞癌的Ⅰ期卵巢癌miRNA的表達，透明細胞癌以高表達miR-30a-3p為特征，黏液性癌表現(xiàn)為高表達miR-192[15]。miRNAs在卵巢腫瘤組織與正常組織間的表達差異具有一定的普遍性，當前研究表明miRNA-200家族在漿液性卵巢癌的發(fā)病機制中起著類似癌基因的作用，可用于漿液性卵巢癌的早期診斷[16]。miRNA-200家族中miRNA-200b的過度表達顯著促進了漿液性卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移，并且它的高表達預(yù)示漿液性卵巢癌的不良預(yù)后。miRNA-21在卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等多種標本以及細胞系都有檢測出其水平異常升高，其能通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因或轉(zhuǎn)移抑制基因的功能，從而發(fā)揮促癌作用[17]。本研究顯示卵巢癌組中血漿miR-21、miRNA-200b相對表達量顯著高于良性組與對照組(P<0.05)，miR-21、miRNA-200b在良性組與對照組中的相對表達量對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當前也有研究表明miR-21及miR-200家族的低表達能促進卵巢腫瘤細胞的上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，從而提高細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[18]。miRNA-200b的表達升高與卵巢癌的化療耐藥性有直接關(guān)系，miRNA-200b能夠抑制具有促進上皮細胞轉(zhuǎn)化過程的基因表達。

miRNAs與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，較多的癌基因、抑癌基因以及和細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成等有關(guān)的基因均不同程度地受miRNA的調(diào)控，但目前有關(guān)卵巢組織miRNAs的研究相對較少。在卵巢腫瘤中，一些miRNA表達升高和一些miRNA低表達。有學(xué)者研究了卵巢上皮性腫瘤患者的miRNAs表達情況，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)倍數(shù)最高的包括miR-200b、miR-141，下調(diào)倍數(shù)最高的有miR-199a、miR-140等[19]。本研究顯示不同臨床分期、分化程度卵巢癌患者的miRNA-200b及miRNA-21表達量對比差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有研究顯示miRNA-200b定位1號染色體，與漿液性卵巢癌的復(fù)發(fā)和總生存期顯著相關(guān)[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織的miR-21的相對表達量明顯高于良性腫瘤及正常對照組，miR-21參與了腫瘤細胞的侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移的過程[21]。

miRNA在真核生物中可通過與靶mRNAs分子中3'-非翻譯區(qū)結(jié)合后，使mRANs結(jié)構(gòu)改變，從而調(diào)節(jié)機體細胞的分化、增殖、凋亡等一系列生理與病理過程。miR-21參與調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，miR-21通過參與卵巢癌間質(zhì)成纖維細胞的轉(zhuǎn)化影響卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[22]。本研究直線相關(guān)分析顯示卵巢癌血漿miRNA-200b與miRNA-21表達量成正相關(guān)性(P<0.05)。不過同一種miRNA在不同腫瘤中表達是不同的，可能由于一種miRNAs調(diào)控多種靶基因，miRNAs的表達又是受多基因調(diào)控的結(jié)果，且靶基因的功能又是多種多樣的，所以miRNAs可表現(xiàn)出組織特異性[23]。

總之，血漿miRNA-200b與miRNA-21在卵巢癌中呈現(xiàn)高表達狀況，與卵巢癌的臨床分期與組織學(xué)分化程度顯著相關(guān)，兩者可相互影響，在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮癌基因的功能。