某地區(qū)養(yǎng)殖戶家禽禽流感的實(shí)驗(yàn)室診斷

田啟會

摘 ?要：為了防止禽流感的大規(guī)模暴發(fā)，減輕對人類健康的影響，本試驗(yàn)采用熒光免疫層析法對某地區(qū)養(yǎng)殖戶的100羽患病雞進(jìn)行診斷。結(jié)果顯示，通過H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測，該地區(qū)的100羽疑似患病雞樣本中，H5N1、H5N2亞型禽流感抗原檢出陽性，而H9N2亞型禽流感抗原、H6N6亞型禽流感抗原結(jié)果為陰性;能檢出H5N1、H5N2亞型禽流感病毒抗原100倍的稀釋度;10次檢測H5N1亞型禽流感抗原的變異系數(shù)為0.95%（P<0.05），差異不顯著。此次診斷表明，該地區(qū)存在H5N1和H5N2型禽流感，不存在其他血清型的禽流感。

關(guān)鍵詞：禽流感;間接熒光免疫試驗(yàn);預(yù)防;飼養(yǎng)管理

中圖分類號：S855 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2019）06-0058-02

1 ?材料與方法

1.1 采樣

筆者于2018年4月份在某地區(qū)家禽養(yǎng)殖戶中采集家禽樣本，采集對象為散養(yǎng)雞（養(yǎng)殖規(guī)模幾百到一千羽不等）。每羽雞的泄殖腔拭子和雞喉拭子樣各采集2份，每戶選取2羽患病雞，共50戶養(yǎng)殖戶，總計(jì)400份樣品。用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）保存于-20 ℃，運(yùn)輸時(shí)將其放置于干冰環(huán)境中。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

熒光檢測儀由深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司提供，批號為：20130509。

1.2.2 試劑

H5N1亞型禽流感抗原為哈爾濱生物制品六廠責(zé)任有限公司產(chǎn)品，批號為：20150208。H5N2亞型禽流感抗原為哈爾濱生物制品二廠責(zé)任有限公司產(chǎn)品，批號為：20150403。H9N2亞型禽流感抗原由武漢博沃生物科技有限公司提供，批號為：20160520。H6N6亞型禽流感抗原為哈爾濱獸研所產(chǎn)品，批號為：06606-050412。H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條由武漢博沃生物科技有限公司提供，批號為：20160709。

1.3 方法

1.3.1 特異性試驗(yàn)

用2 mL PBS液分別溶解H5N1亞型禽流感抗原、H5N2亞型禽流感抗原、H6N6亞型禽流感抗原、H9N2亞型禽流感抗原，并用PBS液將其按1∶10的比例進(jìn)行稀釋，然后用移液器吸取75 μL的稀釋液加入H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上，15 min后，用熒光檢測儀讀出數(shù)值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：若cut off值≥80判為陽性，若<80則判為陰性。

1.3.2 敏感性試驗(yàn)

分別用PBS液稀釋10倍、100倍、1 000倍H5N1亞型禽流感抗原和H5N2亞型禽流感抗原，然后用移液器吸取75 μL稀釋液加入H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上， ? ?15 min后，用熒光檢測儀讀出數(shù)值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：若cut off值≥80判為陽性，若<80則判為陰性。

1.3.3 變異系數(shù)試驗(yàn)

用PBS液稀釋100倍H5N2亞型禽流感抗原，用移液器吸取75 μL加入H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上，15 min后，用熒光檢測儀讀取數(shù)值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：若cut off值≥80判為陽性，若<80則判為陰性。

2 ?結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)中，用H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測得到不同的毒株抗原，得出的試驗(yàn)結(jié)果為H5N2亞型禽流感抗原、H5N1亞型禽流感抗原的檢測結(jié)果為陽性，H9N2亞型禽流感抗原、H6N6亞型禽流感抗原檢測結(jié)果為陰性，見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條可以準(zhǔn)確檢測出H5N1、H5N2兩種亞型流感病毒，其中H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條的特異性較強(qiáng)。

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條能夠檢測出10倍和100倍稀釋的H5N1亞型禽流感抗原，而稀釋1 000倍以后的檢測結(jié)果為陰性;稀釋10倍和100倍的H5N2亞型禽流感抗原最終檢測結(jié)果為陽性，而稀釋1 000稀釋倍以后檢測結(jié)果則為陰性，見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條能夠檢出H5N1、H5N2亞型禽流感抗原的最大稀釋倍數(shù)為100倍。

2.3 變異系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)中，H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測得出10次1∶100稀釋的H5N1亞型禽流感抗原，檢測結(jié)果10次均為陽性，見表3。而變異系數(shù)為0.95%，結(jié)果差異并不明顯。試驗(yàn)結(jié)果顯示，H5亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測結(jié)果相對穩(wěn)定。

3 ?結(jié)論

通過對該地區(qū)100羽雞的400份檢疫樣品進(jìn)行熒光免疫檢測，得出該地區(qū)的400份檢疫樣品均存在H5N1、H5N2型禽流感病毒，所以我們需要對該地區(qū)的H5N1、H5N2型禽流感進(jìn)行針對性免疫預(yù)防工作。由于禽流感具有發(fā)病快、傳播迅速、死亡率高等特征，因此日常管理中應(yīng)遵循防重于治的原則，并且在養(yǎng)殖過程中實(shí)施“全進(jìn)全出”的養(yǎng)殖制度，注意雞舍的選址、雞舍的衛(wèi)生環(huán)境以及養(yǎng)殖場工作人員的管理水平。我國關(guān)于禽流感方面的研究工作雖然已走在了世界前列，但是禽流感的檢測與預(yù)防工作還有很大的進(jìn)步空間，這其中仍有重要的科學(xué)問題沒有得到解決，在應(yīng)用和推廣方面也有不足，科研人員和獸醫(yī)工作者依然任重道遠(yuǎn)。□□