Y染色體微缺失與卵胞漿內單精子注射助孕妊娠結局的相關性分析

郭玉錦，濮義福，朱興旺，盧少明

(山東大學附屬生殖醫院，濟南 250000)

近年來，不孕不育的發病率在世界范圍內逐漸上升，已婚育齡夫婦的不孕不育癥發生率約在15%左右，其中約40%～50%是由于男方因素引起[1]。1976年Tiepolo等[2]首先發現人類Y染色體的長臂1區1帶(q11)上有影響精子生成的無精子因子(azoospermia factor，AZF)的存在，將其命名為AZF家族，AZF區域中出現的任何缺失改變都可導致男性出現嚴重少精子癥甚至無精子癥[3]，近年來已成為生殖醫學男科研究中的熱點。研究表明男性因素中Y染色體微缺失與男性不育密切相關，是繼先天性曲細精管發育不完全綜合征(又稱Klinefelter綜合征)后導致男性生精障礙的第二大遺傳學病因[4]，并以美國和東亞不育男性的患病率最高[5]。雖然AZF的微缺失可導致男性不育，但是否會影響其所致的嚴重少精子癥患者行ICSI-ET助孕的胚胎情況及妊娠結局，目前各研究結論不盡相同。本研究回顧性分析了我院2010年1月至2013年12月因男方嚴重少精子癥為指征就診，行ICSI-ET助孕的630對夫婦ICSI助孕的結局，根據Y染色體有無缺失改變將患者分為缺失組和對照組，統計并分析Y染色體微缺失對胚胎發育及移植后妊娠結局的影響。

資料和方法

一、研究對象及分組

收集因男方嚴重少精子癥為指征于2010年1月至2013年12月間在本院行ICSI-ET助孕的夫婦，入組標準：(1)夫妻性生活正常、未采取避孕措施1年以上女方未孕；(2)女方年齡≤40歲，基礎內分泌性激素水平正常并排除女方不孕因素，無子宮畸形、無子宮內膜異位癥、無輸卵管疾病、無多囊卵巢綜合征、無盆腔粘連、無家族遺傳病史等；(3)夫婦均進行染色體核型分析，排除有生育禁忌的染色體結構及數量的畸變；(4)男方均行Y染色體微缺失的檢測；(5)促排卵中女方卵巢反應正常。

并根據Y染色體是否存在微缺失改變將患者分為缺失組和對照組。缺失組167例(共184個ICSI周期)：檢測顯示存在Y染色體微缺失[其中AZFb缺失2例，AZFc缺失5例，AZFd缺失5例，AZF(c+d)缺失154例，AZF(b+c+d)缺失1例]，無其他導致嚴重少精子癥的情況；對照組463例(共528個ICSI周期)：檢測為無Y染色體微缺失，因其他原因所致的嚴重少精子癥。

二、研究方法

1.精液分析：使用世界衛生組織(WHO)精液評估標準：每位男性患者1～2個月內進行3次精液檢測，每次檢測禁欲3～7 d，精子濃度<5×106/ml者為嚴重少精子癥。所有的精液分析均在同一實驗室進行。

2.Y染色體微缺失的檢測：我院生殖中心分子遺傳實驗室采用多重聚合酶鏈反應(PCR)技術進行擴增，檢測Y染色體AZF基因家族9個序列標記位點(STS)：SY84和SY86(AZFa)，RBM1、SY127和SY134(AZFb)，SY254和SY255(AZFc)，SY152和SY153(AZFd)；設置鋅指結構基因(ZFX/ZFY)和Y染色體性別決定基因(SRY)作為內參，并和這9個STS位點分為3組(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組)進行多重PCR反應，M為標記片段(Marker)，以空白及正常女性做對照。具體如圖1所示，空白對照無基因條帶；正常女性對照僅有ZFX基因條帶；正常生育男性對照含有ZFX/ZFY和SRY基因條帶以及9個序列標記位點基因條帶；樣本示例為AZF(c+d)缺失(無SY254、SY255和SY152、SY153標記位點條帶)。對發現存在微缺失的樣本重復進行2次PCR檢測，如果仍無擴增信號，則說明此Y染色體區域有微缺失。

3.遺傳咨詢：攜帶Y染色體微缺失改變的夫婦在接受ICSI-ET助孕之前接受了詳細的遺傳咨詢，并被告知：由于Y染色體微缺失可垂直傳遞，因此自精助孕所產生的男性后代可能會遺傳父源Y染色體微缺失，可能會面臨同樣的生育問題；可選擇行胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)進行醫療性性別選擇或選擇供精人工授精(AID)，并告知患者整個助孕過程中有可能發生的其他相關風險，患者夫婦雙方均事先表示知情同意，并簽署ICSI助孕相關知情同意書。

正常女性對照僅有ZFX基因條帶；正常生育男性對照含有ZFX/ZFY、SRY及9個STS基因條帶；樣本示例缺失SY254、SY255和SY153、SY152位點條帶，為AZF(c+d)缺失圖1 多重PCR電泳檢測圖

4.女方助孕方案：均采用常規長方案促排卵，在女方排卵后1周左右(相當于月經周期21 d)開始使用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長效制劑達菲林(益普生，法國)或者達必佳(默克雪蘭諾，瑞士)1.25～1.88 mg進行垂體降調，14 d后復查，降調滿意后根據患者情況啟動促性腺激素(Gn)果納芬(默克雪蘭諾，瑞士)促進卵泡發育和成熟，B超動態監測女方的卵泡發育情況，卵泡發育至大小1.6～1.8 cm且卵泡數≥3個時，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠集團)，36～38 h后在陰道B超引導下進行穿刺取卵。

5.取精方式：男方患者禁欲2～7 d后在女方取卵當天進行取精，方式為手淫取精。

6.胚胎實驗室處理：手淫取精的精液處理采用密度梯度離心法，在顯微鏡400倍放大倍數視野下挑選形態相對正常的可利用精子。卵母細胞在培養液中充分洗滌后置于受精液G-IVF(Vitrolife，瑞典)中預培養約3 h，用透明質酸酶消化,去除顆粒細胞后的卵母細胞置于G1培養液中預培養0.5 h，將準備好的精子注射入成熟卵母細胞(MⅡ)中，觀察卵母細胞受精情況，取卵后第1天觀察到兩原核(2PN)者為正常受精卵，取卵第3天選擇評分較高的卵裂期胚胎1～3枚進行移植。

7. 觀察指標：胚胎移植后2周檢查血清β-HCG，若≥25 U/L為HCG陽性；于移植后5周行陰道超聲檢查，可見到孕囊者為臨床妊娠。異位妊娠指發生在子宮腔以外的妊娠；早期流產為妊娠12周以前發生的妊娠終止現象；晚期流產為發生在妊娠12周至不足28周者；早產是指妊娠滿28周但不足37周間的分娩；活產為至少生產1個≥28周的活產兒。

其中，受精率=2PN數/MⅡ卵母細胞數×100%；優質胚胎率=優質胚胎數/2PN數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數/移植周期數×100%；早期流產率=妊娠12周前流產的周期數/移植周期數×100%；晚期流產率=妊娠12周后流產的周期數/移植周期數×100%；早產率=早產周期數/移植周期數×100%；活產率=活產周期數/移植周期數×100%；后代男女比例=出生男嬰數/出生女嬰數。

三、統計學分析

結 果

一、缺失組和對照組一般情況比較

缺失組和對照組夫婦中女方年齡、男方年齡、女方基礎FSH、女方體重指數(BMI)、MⅡ卵母細胞數、2PN數、優質胚胎總數、HCG日內膜厚度、移植胚胎數比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、缺失組和對照組妊娠結局比較

缺失組患者的受精率(62.7%)顯著低于對照組(67.8%)(P<0.01)；兩組患者的優質胚胎率(53.0% vs.50.7%)、臨床妊娠率(49.5% vs. 51.7%)、異位妊娠率(0.5% vs. 0.9%)、早期流產率(5.4% vs. 2.8%)、晚期流產率(3.3% vs. 3.0%)、早產率(3.8% vs. 6.4%)、活產率(40.2% vs. 44.9%)、后代男女比例(1.13 vs. 1.09)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

組 別周期數女方年齡男方年齡女方基礎FSH(U/L)女方BMI(kg/m2)MⅡ卵母細胞數缺失組18428.22±3.6429.79±4.186.70±1.2522.18±2.7412.47±4.65對照組52828.53±3.1833.14±3.966.73±1.6122.30±2.7412.28±5.43組 別周期數2PN受精數優質胚胎總數移植胚胎數HCG日內膜厚度(cm)缺失組1847.82±4.014.15±2.912.01±0.411.13±0.15對照組5288.33±4.374.22±3.112.04±0.451.13±0.21

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

目前對于男性不育的遺傳學病因研究越來越多，其中Y染色體微缺失較為常見[6]。已有研究表明AZF微缺失在嚴重少精子癥及無精子癥患者中發病率約為10%[7]。1996年Vogt等[8]將AZF區分為3個區域，分別命名為AZFa、AZFb和AZFc區，這3個區域互不重疊，均可能發生微小缺失的改變，從而造成不同程度的男性睪丸生精功能障礙，導致男性患有嚴重少精子癥甚至無精子癥。Kent-First等[9]通過研究于1999年提出在Y染色體的AZFb區與AZFc區之間存在AZFd區，同樣AZFd區的缺失可導致男性不育。隨著輔助生殖技術的快速發展，嚴重少精子癥患者可通過ICSI-ET技術獲得自己的后代，同時借助輔助生殖技術出生的后代情況也受到越來越多人的關注，Y染色體微缺失是否影響其受精率、胚胎質量、繼續妊娠能力等妊娠結局，目前的研究仍存在爭議。

本研究在夫妻雙方如男女方年齡、女方基礎FSH、女方BMI、卵母細胞數等比較均無統計學差異(P>0.05)的情況下，比較了有Y染色體微缺失與無Y染色體微缺失的嚴重少精子癥患者的胚胎正常受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率、早期流產率、早產率、活產率、后代男/女比例等指標，結果發現缺失組的受精率顯著低于對照組(P<0.01)，但兩組患者的優質胚胎率、臨床妊娠率等妊娠結局指標比較無顯著性差異(P>0.05)。推測其可能原因為：Y染色體微缺失會使精子的受精能力降低，從而無法激活卵母細胞，導致行ICSI助孕的正常受精率降低，但尚未影響其妊娠結局，提示精卵一旦成功受精，胚胎發育將不受Y染色體微缺失的影響，形成優質胚胎及繼續妊娠的能力兩組間并無明顯差異。與van Golde等[10]、Liu等[11]研究提出的Y染色體微缺失組的受精率明顯低于無Y染色體微缺失組的結論相同。也有學者的研究發現兩組的受精率并無差異[12-15]，這提示我們需要更大的樣本量進一步研究Y染色體微缺失改變與胚胎異常受精有無直接關系。

Y染色體的完整性與否對于維持胚胎的繼續妊娠能力有無影響，國內外學者目前的研究結論不盡相同，仍存在較大爭議[16-17]，Mateu等[18]研究表明Y染色體微缺失的患者其精子發生非整倍體比例會增高，導致出現較多的非整倍體胚胎，從而增加了其早期流產的風險。肖宗輝等[19]的研究數據亦顯示Y染色體微缺失組患者的早期流產率及晚期流產率顯著高于未缺失組，提示Y染色體微缺失可能會增加患者的流產率。但Wettasinghe等[20]則認為Y染色體的微缺失與復發性流產的發生并無關系，郭麗[21]、Zhu等[22]研究結論則認為Y染色體的微缺失并不影響其配偶的繼續妊娠，與流產無關。本研究數據顯示缺失組早期流產率及晚期流產率有高于對照組的趨勢，但差異尚無統計學意義，提示我們后續需要進行更大樣本量的研究來進一步探討Y染色體微缺失與維持胚胎發育和繼續妊娠之間的關系。

本研究數據顯示兩組后代男女性別比例相近，組間比較無統計學差異，與之前部分文獻報道較一致。Komori等[23]認為ICSI助孕技術可以幫助Y染色體微缺失的患者獲得后代的同時也會將Y染色體微缺失傳遞給男性后代，導致男性后代同樣不育，而不會提高女性后代不孕的風險，并且男性后代可能出現Y染色體微缺失片段長度長于其父親，即出現擴大傳遞現象。因此建議嚴重少精子癥的的不育男性進行Y染色體微缺失檢測，對于患有Y染色體微缺失的患者，以便夫妻雙方能夠做出明智的選擇是否行PGT選擇女性胚胎移植或改行AID助孕[5]。但對于Y染色體微缺失擴大傳遞的具體數據鮮有文獻報道，需進一步行隊列隨訪研究。

綜上所述，Y染色體微缺失引起的嚴重少精子癥患者在ICSI-ET治療結局中，胚胎正常受精率會明顯降低，但最終的妊娠結局并未受到影響，且子代的男/女比例無統計學差異?？紤]到Y染色體微缺失的垂直傳遞會使其男性后代面臨同樣的生育問題，行PGT選擇女性胚胎移植或AID的助孕方式可以切斷Y染色體微缺失的遺傳途徑，所以Y染色體微缺失的男性患者面臨不育問題時可建議其行遺傳咨詢選擇助孕方式，達到后代優生優育的目的。