克羅米酚對多囊卵巢綜合征患者血清中NO、IL-10及MMP-9的調節作用

康曉麗，杜海燕

(內蒙古醫科大學第三附屬醫院婦產科生殖醫學中心，包頭 014010)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種非常普遍的生殖內分泌紊亂疾病，6%～8%的育齡婦女因此無法正常受孕[1]。研究表明，15～24歲的年輕女孩患PCOS的比例約為22.5%[2]。無排卵是PCOS患者中亟需解決的一個難題，研究認為是由微血管功能障礙和慢性炎癥導致的[3]。一氧化氮(NO)是內皮細胞功能正常的標志物，通常在卵巢卵泡形成過程中有所增加，以助于維持妊娠[4]。研究顯示，不孕PCOS婦女中內皮細胞功能障礙增加了妊娠失敗的幾率[5]。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種參與細胞外基質降解的蛋白酶，與排卵、胚胎發育、囊胚植入、器官發生等重要的生殖生物學過程有關，而這些都是成功妊娠必不可少的。先前的研究已經證明PCOS患者血清中MMP-9水平升高，認為MMP-9水平升高可能與自發性妊娠失敗有關[6]。另外，由于在PCOS中存在促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的不平衡，從而維持了慢性亞臨床低度炎癥狀態[7]。IL-10是一種抗炎細胞因子，通過其多效性作用以及低水平來維持妊娠，同時已被證實在PCOS中的表達水平較低[8]。克羅米酚(Clomiphene Citrate，CC)作為臨床常用促排卵藥物，常規用于治療PCOS患者的排卵障礙，研究證實應用CC使PCOS患者的排卵和妊娠率得到顯著改善[9]。由于NO、IL-10和MMP-9與PCOS的致病機制有著重要的相關性，本研究希望通過評估CC對PCOS不孕女性血清NO、IL-10和MMP-9水平的影響，來進一步探索PCOS的發病機制，從而為治療PCOS提供新的思路。

材料和方法

一、研究對象

選擇2017年1～12月在內蒙古包鋼醫院生殖醫學中心就診的141例PCOS患者進行研究。納入標準：(1)年齡20～35歲；(2)確診PCOS的患者，診斷標準采用2003年修訂的鹿特丹標準[10]。排除標準：(1)既往有其他不孕癥病史的婦女，如輸卵管因素、男性因素不孕；(2)前6個月使用口服避孕藥、二甲雙胍、地塞米松或其他輔助治療的患者；(3)患有心血管疾病、甲狀腺疾病、糖尿病、高血壓、腎功能不全、炎癥性疾病或卵巢功能減退的患者。所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.治療方案：給予患者口服CC，患者于月經周期第5～10天，每日口服50 mg CC(上海衡山藥業)用于促排卵治療。

2.樣本采集：治療前和用CC治療4周后分別從患者中獲得5 ml靜脈血樣，兩組采血時間無顯著性差異。將血清分離并儲存在-80℃，用于分析NO、IL-10和MMP-9水平。

3.分組：B超監測無優勢卵泡生長的患者判定為未排卵組，HCG后48 h后陰道超聲確認排卵的患者判定為排卵組。排卵后14 d測血β-HCG陽性且于28 d腹部B超觀察到妊娠囊及胎心搏動判定為臨床妊娠的患者為妊娠組，血β-HCG陰性判定為未妊娠組。

4.血清NO、IL-10和MMP-9水平測定：IL-10、MMP-9試劑盒購自墨西哥Raybiotech公司，NO試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。嚴格按照說明書進行操作，運用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)試劑盒檢測血清中IL-10和血清MMP-9的含量，通過改良Griess法[11]測定NO水平。

5.排卵和妊娠判定：患者于月經第8～10天起根據卵泡生長速度進行B超監測，當卵泡直徑≥18 mm時，皮下注射HCG 5 000～10 000 U誘發排卵。HCG注射日取肘靜脈血測定LH、E2、P，并記錄當日子宮內膜厚度、成熟卵泡數目。注射HCG后24～36 h指導患者同房，48 h后陰道超聲確認排卵。所有患者在排卵后給予口服地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭) 10 mg，2次/d。排卵后14 d測血β-HCG明確是否懷孕，陽性者于排卵后28 d腹部B超觀察到妊娠囊及胎心搏動判定為臨床妊娠。

三、統計分析

結 果

一、一般情況及臨床特征

本研究患者的平均年齡(25.51±2.72)歲，體重指數(BMI)(26.81±2.53)kg/m2，平均不孕年限(2.68±0.68)年；141例患者中，有118例(83.7%)原發不孕，23例(16.3%)患有繼發性不孕；大多數患者月經周期不規律(122例，86.5%)、超重(90例，63.8%)；59例(41.8%)患者具有多毛癥，37例(26.2%)患者存在痤瘡問題(表1)。

二、CC治療對血清NO、IL-10和MMP-9的影響以及臨床結局

1.CC治療的總體影響：CC治療后與治療前相比，患者血清中IL-10和NO水平均顯著升高(P<0.05)，MMP-9顯著降低(P<0.05)；治療后，75例患者(53.2%)排卵，29例患者(20.6%)妊娠(表2)。另外，B超結果顯示，對比同一患者治療前后，卵泡發育情況得到顯著改善(圖1)。

組 別例數NO(mmol/L)IL-10(ng/L)MMP-9(mg/L)排卵臨床妊娠治療前14117.23±4.734.53±2.152 886.92±769.16--治療后14117.56±4.55*7.89±3.62*2 498.51±669.39*75 (53.2)29(20.6)

注：與治療前比較，*P<0.05

圖1 患者口服CC前后周期的不同時相卵泡發育情況

2.CC對不同促排卵結局患者血清中NO、IL-10和MMP-9的影響：CC治療后與治療前相比，排卵組和未排卵組的IL-10水平均顯著升高(P<0.05)、排卵組MMP-9水平顯著降低(P<0.05)，而NO水平在兩組治療前后均無顯著性變化(P>0.05)；對比排卵組和未排卵組，治療前IL-10、MMP-9和NO水平均無顯著性差異(P>0.05)，治療后排卵組的MMP-9水平顯著低于未排卵組(P<0.01)，IL-10和NO水平的水平無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

組 別例數IL-10(ng/L)NO(mmol/L)MMP-9(mg/L)治療前治療后治療前治療后治療前治療后排卵組 754.24±1.517.25±3.12*15.08±3.8716.37±5.752 799.09±819.282 354.17±623.11*#未排卵組664.82±3.588.12±4.88*18.36±4.5820.15±4.542 663.07±769.032 805.11±589.98*

注：與同組治療前相比，*P<0.05；與未排卵組相比，#P<0.01

3.CC對不同妊娠結局患者血清中NO、IL-10和MMP-9的影響：在妊娠組和排卵未妊娠組中，與治療前相比，IL-10均顯著增加(P<0.05)而MMP-9均顯著降低(P<0.01)，NO水平均無顯著性變化(P>0.05)。對比妊娠組和未妊娠組，治療前IL-10、MMP-9和NO水平均無顯著性差異，治療后妊娠組的MMP-9水平顯著低于未妊娠組(P<0.01)，IL-10和NO水平的水平無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

組 別例數IL-10(ng/L)NO(mmol/L)MMP-9(mg/L)治療前治療后治療前治療后治療前治療后妊娠組 373.88±2.075.22±3.44*15.85±5.1218.16±3.353 073.37±873.412 351.26±621.34*△未妊娠組383.39±1.588.58±3.25*17.34±3.4816.55±4.242 850.22±734.122 644.52±654.33*

注：與同組治療前相比，*P<0.05；與未妊娠組相比，△P<0.01

討 論

本研究通過對PCOS排卵障礙患者進行CC誘導排卵治療后檢測患者血清中MMP-9、IL-10以及NO的水平，結果顯示，與治療前相比患者血清中IL-10和NO水平顯著增加(P<0.05)，而MMP-9顯著降低(P<0.05)。

據報道，MMP-9通過其對卵巢組織周期性重建參與PCOS的發病機理[12]，PCOS患者中卵泡閉鎖與MMP-9水平的升高有關[13]。本研究中，PCOS患者用CC治療后血清中MMP-9水平與其治療前水平相比顯著降低，對比排卵組和未排卵組，治療后MMP-9的水平顯著下降(P<0.01)。驗證了與正常婦女低水平的MMP-9相比，PCOS患者的無排卵與MMP-9水平升高之間存在相關性[14]。研究表明，NO在女性生殖過程中發揮重要作用，NO可使子宮肌層放松、增加子宮血流量、降低胎兒血管阻力，有利于胎盤和胚胎發育[15]。PCOS中NO水平的降低破壞了對其妊娠的保護作用，導致自然流產和不孕。本研究結果顯示，接受CC治療后的PCOS患者血清中NO水平顯著升高，可能是由于CC可增加雌二醇水平，從而通過刺激NO合成酶導致NO水平升高。另外，有研究表明，PCOS患者體內存在慢性炎癥狀態[16]，并且有研究調查CC對炎癥標志物如C反應蛋白的影響，但沒有關于CC對IL-10等抗炎細胞因子影響的研究。本研究顯示用CC治療后患者血清IL-10水平顯著升高，表明其炎癥狀態得到改善。

除此以外，當患者根據是否存在排卵進行分組時，排卵組治療前后IL-10水平顯著升高，MMP-9水平顯著降低。盡管NO水平相比有所增加，但差異并不顯著。對比治療后排卵組和未排卵組，同樣無顯著性差異。這可能是由于NO水平在卵泡發育過程中增加，但排卵后NO水平降低。另據報道，IL-10水平的增加可抑制NO的產生[17]。另外，CC治療后，未排卵組的IL-10水平輕度升高，但MMP-9水平和NO水平均無顯著變化。當治療后的排卵組和未排卵組比較時，發現排卵組中MMP-9比未排卵組進一步降低(P<0.01)。盡管CC降低MMP-9水平和增加IL-10水平的詳細工作機制尚不清楚，但本研究結果表明CC治療能通過減少炎癥和降低MMP-9水平來改善排卵。

當妊娠組和未妊娠組比較時，我們發現與治療前相比，治療后兩組中的MMP-9顯著降低、IL-10顯著增加，但是兩組中NO水平均無顯著性差異。當用CC治療后比較兩組之間生化參數的變化幅度時，與未妊娠組相比，只有MMP-9的水平顯著降低。MMP-9對成功的胚胎植入和胎盤形成至關重要，因為它促進胎兒滋養層細胞在植入和形成胎盤過程中附著和侵入子宮內膜。因此，我們推測CC治療后MMP-9的減少可能是PCOS患者受孕的有利因素。據報道，炎癥減輕有助于胚泡植入和維持母體子宮內膜血管功能[18]。在本研究中，排卵組和妊娠組的IL-10升高，提示CC治療后炎癥減輕可能是提高PCOS患者妊娠率的因素之一[19]。據研究報道，大約15%～40%的PCOS患者被發現對CC耐藥[20]。由于沒有標記可以預測PCOS患者的CC抗性，因此需要進一步來研究NO、MMP-9和IL-10水平是否可以用作預測PCOS患者CC抗性的標記物。如果證明這些標記物可以預測CC耐藥性，那么臨床醫師可以根據它們的水平決定PCOS患者是否應該用CC或促性腺激素還是腹腔鏡卵巢鉆孔術來治療。

總之，用CC誘導的排卵能增加NO和IL-10的水平，并降低MMP-9的水平，特別在CC治療后的排卵組和妊娠組患者中顯著降低了MMP-9的水平，同時也提高了PCOS不孕婦女的排卵率和臨床妊娠率。但需要進一步的研究來分析增加劑量的CC對這些參數的影響，以及CC改變這些參數的機制。