積雪草酸抑制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用

吳少科 陳曉駟 陳海聰 譚小艷 胡資兵 魏波 黃成碩魏勁松 劉田豐

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1骨外科，2VIP病區(qū)（廣東湛江524023）

骨質(zhì)疏松癥是一種以成骨細(xì)胞凋亡加快，破骨細(xì)胞增多造成局部骨量大量丟失、骨脆性增加的一種代謝性疾病，同時(shí)骨質(zhì)疏松癥患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)度增加。近年來(lái)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐漸增多，有研究報(bào)道全球30%的人患有骨質(zhì)疏松癥，其中60歲以上老人骨質(zhì)疏松癥的患病率更嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)到60%以上，然而女性發(fā)病率大于男性［1］。老年人絕經(jīng)后因其雌激素分泌減少，這導(dǎo)致骨量的大量丟失，同時(shí)脊柱、髖骨、手腕等部位較易發(fā)生骨折，且發(fā)生骨折后難以愈合，更有甚者會(huì)引起死亡，給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此尋找一種可以有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。積雪草酸是一種五環(huán)三萜酸，具有廣泛的生物學(xué)作用。過(guò)去積雪草酸主要是用于一些皮膚創(chuàng)傷及慢性潰瘍的臨床治療，近來(lái)隨著對(duì)積雪草酸藥理活性的研究，發(fā)現(xiàn)積雪草酸還具有治療癡呆癥、腫瘤等老年性疾病的作用［2］。有文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道積雪草酸對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖活性具有調(diào)節(jié)作用，可以防治骨髓瘤的惡化，同時(shí)其能抑制骨基質(zhì)細(xì)胞的脂肪分化。那么積雪草酸能否防治老年人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松呢？這將是本課題組的研究重點(diǎn)。本課題采用去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型探討積雪草酸的抗骨質(zhì)疏松作用，現(xiàn)具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組42只3個(gè)月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量（257±27.1）g，動(dòng)物合格證：SCXK（粵）2011-0015。適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量對(duì)等原則隨機(jī)分成6組，每組7只，第一組為假手術(shù)組，僅切除雙側(cè)卵巢附近脂肪組織，且每天給予灌胃生理鹽水［3 mL/（kg·d）］；第二組為去卵巢組，行雙側(cè)去卵巢手術(shù)后每天給予灌胃生理鹽水［3 mL/（kg·d），建立骨質(zhì)疏松模型［5］；第三組為低劑量積雪草酸組，行雙側(cè)去卵巢手術(shù)后每天給予灌胃積雪草酸［80 mg/（kg·d）］；第四組為中劑量積雪草酸組，行雙側(cè)去卵巢手術(shù)后每天給予灌胃積雪草酸［100 mg/（kg·d）］；第五組為高劑量積雪草酸組，行雙側(cè)去卵巢手術(shù)后每天給予灌胃積雪草酸［120 mg/（kg·d）］；第六組為陽(yáng)性對(duì)照雌二醇組，行雙側(cè)去卵巢手術(shù)后每天皮下注射苯甲酸雌二醇0.02 mg/kg。實(shí)驗(yàn)周期為90 d，每周大鼠稱(chēng)重一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前12 h禁食，用3%戊巴比妥鈉（1.5 mg/kg）行腹腔注射麻醉后右心室徹底抽血分離血清，取右側(cè)股骨置于生理鹽水潤(rùn)濕的紗布中，并用錫紙包裹防止水分蒸發(fā)，用于指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2試劑與器材積雪草酸中藥材購(gòu)于東莞國(guó)藥有限公司，羅蓋全購(gòu)于上海羅氏制藥有限公司，低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯測(cè)試盒購(gòu)于南京建成公司；RT-qPCR反逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR熒光染料購(gòu)于TaKaRa公司，ALP抗體及內(nèi)參購(gòu)于abcam公司，Micro-CT掃描儀（美國(guó)Latheta，型號(hào)LCT200）、酶標(biāo)儀（北京普朗醫(yī)療，型號(hào)DNM-9606）、微量移液器（美國(guó)eppendorf，Research Plus系列）、冷凍離心機(jī)（美國(guó)eppendorf，型號(hào)5415R）等常規(guī)設(shè)備均由本試驗(yàn)室提供。

1.3工作液的制備取積雪草酸中藥材500 mg，先用適量二甲基亞砜充分溶解混勻，再用生理鹽水稀釋、混勻，定容至100 mL，配成濃度為5 mg/mL的積雪草酸工作液，其中二甲基亞砜濃度低于0.1%，常溫避光保存。

1.4大鼠血脂水平的檢測(cè)檢測(cè)方法按照LDL、TG、TC試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，樣品準(zhǔn)備好后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定，并按說(shuō)明書(shū)提供的計(jì)算方法得出血清中的血脂水平。

1.5大鼠股骨Micro-CT掃描將處理好的股骨遠(yuǎn)心端（已截?cái)啵?biāo)本沿長(zhǎng)軸垂直固定于樣品固定器內(nèi)，vivaCT40選擇掃描參數(shù)：圖像矩陣為1024× 1024，整合時(shí)間為200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp、114 μA、8 W。以0°旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描，掃描完成后，選取距生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.5 mm、層厚3.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域行三維重組，以最低閾值為170提取圖像信息。獲得重組圖像后，使用Micro CT自帶的軟件進(jìn)行定量分析。物理參數(shù)分析如下：骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度。

1.6大鼠股骨堿性磷酸酶（ALP）的Real-time PCR檢測(cè)首先取出大鼠股骨約0.6 g，放入預(yù)冷的研缽中，同時(shí)往研缽中倒入液氮，手持研棒迅速將股骨研至細(xì)粉。其次將研制股骨粉末用Trizol進(jìn)行溶解，提取股骨RNA，再參照RT-qPCR反逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，最后在SYBR熒光顏料的作用下Real-time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。ALP及β-actin引物序列見(jiàn)表1。

表1 ALP與β-actin引物序列Tab.1 The internal reference sequences of ALP and beta-actin

1.7大鼠股骨DKK1蛋白的Western Blot測(cè)定取出大鼠股骨，參照1.6方法進(jìn)行液氮研磨，其次將股骨研磨粉末用裂解液進(jìn)行蛋白提取，參照BCA蛋白測(cè)定盒檢測(cè)所提取蛋白的含量，并計(jì)算相應(yīng)的量用于進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，其操作步驟依次為：配膠、灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、剪膜、封閉、抗體抗原反應(yīng)、曝光成像、灰度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，對(duì)假手術(shù)組與去卵巢組之間進(jìn)行方差分析；去卵巢組與低中高劑量積雪草酸組、去卵巢組與雌二醇組之間進(jìn)行方差分析；計(jì)算比較兩組的F值，查閱F界值表，當(dāng)P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠各周體質(zhì)量變化大鼠各周的體質(zhì)量變化見(jiàn)表2。與Sham組相比，OVX組大鼠體質(zhì)量均較低，且在第2、4、6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠體質(zhì)量在前6周內(nèi)較小，第6周后較大，其中第2、8周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，M-AA組大鼠體質(zhì)量均較大，其中在第3、10周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），H-AA組大鼠體質(zhì)量在前4周較小，在第4周后則較大，其中在第8、10、12周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E2組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間均較大，其中在第10、12周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠體重變化Tab.2 Changes of body weight in rats of different groups（n=7） x ± s，g

2.2積雪草酸對(duì)大鼠血脂水平的影響各組大鼠低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3。與Sham組相比，OVX組大鼠LDL、TC、TG均增高，其中LDL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中LDL、TC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），L-AA組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中TG差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），H-AA組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中LDL、TG具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），E2組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中TG、TC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3積雪草酸對(duì)大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)的影響各組大鼠股骨干骺段模型指數(shù)、骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度、骨小梁厚度Micro-CT 掃描值見(jiàn)表4，大鼠股骨微結(jié)構(gòu)3D重建見(jiàn)圖1。

表3 各組大鼠血脂水平Tab.3 The level of serum lipid in rats of different groups（n=7） x ± s，mmol/L

圖1 各組大鼠股骨微結(jié)構(gòu)3D重建圖Fig.1 The 3D reconstruction microarchitecture of the femur of different groups

表4 各組大鼠股骨Micro-CT掃描值Tab.4 The result of the femur scanned by Micro-CT in each groups（n=7） x ± s

如表4所示，與Sham組相比，OVX組大鼠SMI、Tb.Sp升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OVX組相比，L-AA組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，SMI、Tb.Sp降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，M-AA組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，SMI降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），H-AA組大鼠BMD、Tb.N升高差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E2組大鼠SMI降低，BMD、Tb.Th升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從圖1也可以看出，OVX組大鼠股骨骨丟失嚴(yán)重，Sham、H-AA、E2這3組大鼠骨量丟失不明顯（P＜0.05），L-AA、M-AA組則存在少量骨丟失。

2.4 積雪草酸對(duì)大鼠股骨ALP表達(dá)量的影響從大鼠股骨提取的目的基因，然后進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)3次ALP的表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5與圖2。

表5 各組大鼠股骨ALP的相對(duì)表達(dá)水平Tab.5 The expression level of rat ALP in each groups

圖2 積雪草酸對(duì)大鼠股骨ALP表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of AA on ALP mRNA expression

從圖2可以看出，與Sham組相比，OVX組大鼠ALP表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠ALP表達(dá)量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），M-AA組大鼠ALP表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），H-AA組大鼠ALP表達(dá)量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E2組大鼠ALP表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 積雪草酸對(duì)大鼠股骨DKK1蛋白表達(dá)量的影響從大鼠股骨提取的目的蛋白，然后進(jìn)行Westerm Blot檢測(cè)3次DKK1蛋白的表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 積雪草酸對(duì)大鼠股骨DKK1表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of AA on DKK1 expression

從圖3可以看出，與Sham組相比，OVX組大鼠DKK1表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠DKK1表達(dá)量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），M-AA組大鼠DKK1表達(dá)量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），H-AA組大鼠DKK1表達(dá)量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E2組大鼠DKK1表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是老年人骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因，主要表現(xiàn)為骨量減少，骨脆性增加。本實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)月齡大鼠去卵巢進(jìn)行骨質(zhì)疏松造模，因?yàn)?個(gè)月齡大鼠生理狀態(tài)相當(dāng)于人類(lèi)青春期，體質(zhì)量和生殖器發(fā)育已趨穩(wěn)定，骨形成與骨吸收基本處于平衡狀態(tài)［6］；另外大鼠骨質(zhì)疏松模型是一個(gè)逐漸形成的過(guò)程，去卵巢后大鼠還需經(jīng)過(guò)幾個(gè)月飼養(yǎng)，骨質(zhì)疏松癥才會(huì)形成，在去卵巢后幾個(gè)月時(shí)間里，大鼠骨骺開(kāi)始封閉，骨代謝變得相對(duì)穩(wěn)定，骨小梁面積百分率下降且密度減少，骨小梁間隙增大等，提示骨質(zhì)疏松癥形成，此時(shí)大鼠的生理狀態(tài)相當(dāng)于婦女的絕經(jīng)期。本實(shí)驗(yàn)在大鼠骨質(zhì)疏松形成的過(guò)程中開(kāi)始給藥積雪草酸，并且要在骨質(zhì)疏松形成后與模型組大鼠進(jìn)行骨質(zhì)疏松指標(biāo)檢測(cè)，飼養(yǎng)90 d后進(jìn)行指標(biāo)觀察。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組大鼠比較，去卵巢組大鼠體質(zhì)量明顯降低，血清LDL、TC、TG增高，股骨SMI、Tb.Sp指標(biāo)升高，但BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th指標(biāo)降低；ALP的表達(dá)量降低，ALP作為一種與骨鈣化密切相關(guān)的蛋白，是骨形成的重要標(biāo)記，是評(píng)估骨形成和骨轉(zhuǎn)化的主要指標(biāo)，因此提高ALP的活性能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，可發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，其表達(dá)量降低則說(shuō)明骨細(xì)胞的增殖與分化減弱，加速了骨質(zhì)疏松的形成；低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（DKK1）表達(dá)量升高，有文獻(xiàn)報(bào)道大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松的形成可能與阻斷Wnt傳遞生長(zhǎng)刺激信號(hào)相關(guān)，在Wnt信號(hào)通路中，DKK1是低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5的強(qiáng)抑制劑［7］，可抑制LRP5/LRP6，進(jìn)而阻止成骨細(xì)胞的增殖與分化，導(dǎo)致骨形成功能下降。以上表明去卵巢組大鼠骨質(zhì)疏松模型形成。

雌激素水平的降低是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體骨骼中存在著雌激素和甲狀腺激素受體，在正常情況下雌激素可降低骨骼對(duì)甲狀腺激素的敏感性，減少甲狀腺激素對(duì)甲狀腺激素受體的結(jié)合，增加對(duì)降鈣素的敏感性，促進(jìn)骨膠原生成、抑制骨吸收，促進(jìn)骨生成［8］。而去卵巢大鼠由于雌激素水平的較低，促進(jìn)甲狀腺受體與甲狀腺激素的結(jié)合，破壞了骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，造成骨質(zhì)丟失嚴(yán)重，骨形成減少，導(dǎo)致了大鼠骨質(zhì)疏松癥的形成［9］。同時(shí)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)與OVX組大鼠比較，E2組大鼠SMI均降低，BMD、Tb.Th升高，股骨ALP表達(dá)量升高，DKK1表達(dá)量降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致。綜上所述雌二醇可以抑制大鼠去卵巢后骨質(zhì)疏松的形成。

積雪草酸是從藥用植物積雪草中提取的三萜酸，屬于五環(huán)三萜酸類(lèi)化合物中的烏蘇烷型。有報(bào)道證實(shí)積雪草酸對(duì)實(shí)體瘤具有顯著的增殖抑制作用，如多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)采用積雪草酸提取液進(jìn)行研究，分為低中高濃度積雪草酸提取液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種濃度的積雪草酸提取液均可以提升大鼠股骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ALP，并減低SMI、Tb.Sp、DKK1。骨質(zhì)疏松癥是一種以單位體積內(nèi)骨量減少、皮質(zhì)骨變薄、骨微結(jié)構(gòu)退化、骨生物力學(xué)性能降低、骨脆性增加容易致使骨折發(fā)生的系統(tǒng)性代謝疾病［10］。積雪草酸可以通過(guò)增加骨量來(lái)調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥狀，其主要是通過(guò)調(diào)節(jié)股骨ALP、DKK1的相對(duì)表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)有研究［4］表明積雪草酸在抗人成骨細(xì)胞凋亡方面具有重要作用，正常情況下成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞是處以一種平衡狀態(tài)，當(dāng)成骨細(xì)胞大量凋亡或者破骨細(xì)胞大量增殖時(shí)，機(jī)體處以一種骨質(zhì)疏松骨量丟失的狀態(tài)，因此減少成骨細(xì)胞凋亡也將有利于減緩骨質(zhì)疏松癥。綜上所述，積雪草酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)ALP、DKK1，降低成骨細(xì)胞的凋亡來(lái)防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。去卵巢模擬絕經(jīng)期可以建立骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型，同時(shí)給于積雪草酸能有效地改善大鼠骨質(zhì)疏松癥，其積雪草酸的防治作用與陽(yáng)性藥物雌二醇作用相當(dāng)。