伴與不伴糖尿病腎病的糖尿病視網膜病變患者血漿蛋白質組學研究

李志琛 劉穎 何徐軍 梅偉群 陳建斌 張華北 歐陽建 錢佳麗

1解放軍第903醫院內分泌科（杭州 310004）；2浙江省人民醫院浙江省胃腸病學重點實驗室（杭州 310013）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）和糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）兩個主要微血管并發癥，其帶來的視力喪失及腎功能衰竭成為嚴重的公共健康問題。DR、DN的確切發病機制尚未明確，DR患者中，較多同時或先后發生DN，也有部分僅有DR而未發生DN，說明單純DR與DR伴DN患者之間存在不同的致病機制。血漿中具有大量生理功能且豐富多變的蛋白質，其組成和含量的變化成為相關疾病的重要標志［1］。目前針對單純DR與DR伴DN患者之間血漿蛋白質組學差異尚未見報道。本研究應用label-free蛋白質組定量技術，尋找單純DR與DR伴DN患者間差異表達蛋白，為進一步篩選二者間不同的血漿標志物提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2012年2月至2012年10月就診于我院的16例T2DM患者，8例DR伴DN患者納入DNDR組，8例單純DR患者納入DR組。DR組男4例，女4例，年齡33歲～69歲，平均（43.32±6.14）歲，糖化血紅蛋白6.10%～7.50%，平均（6.74±0.45）%，DNDR組男5例，女3例，年齡35歲～67歲，平均（44.57±6.35）歲，糖化血紅蛋白6.30%～7.40%，平均（6.89±0.51）%，兩組患者性別、年齡、糖化血紅蛋白差異均無統計學意義（P＞0.05）。所有患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準。納入標準：（1）依據2002年DR國際分期標準：雙眼眼底彩色照相檢查符合中度以上非增殖性DR或增殖性DR。（2）依據2012年ADA篩查和診斷標準：測定即時尿標本的白蛋白/肌酐（urinary albumin/creatinine ratio，ACR）≥ 30 μg/mg，3 個月內 3 次ACR至少有2次升高。符合以上2條標準納入DNDR組；僅符合（1），且ACR＜30μg/mg納入DR組。排除標準：（1）冠心病、高血壓病、惡性腫瘤等慢性疾病患者；（2）T1DM、妊娠糖尿病和特殊類型糖尿病；（3）嚴重眼部疾患影響眼底檢查者；（4）青光眼、葡萄膜炎及其他視網膜疾病者；（5）劇烈運動、發熱、尿路感染、腎病綜合征等其他原因導致ACR升高。入組患者均知曉研究方案并簽署知情同意書且經903醫院倫理委員會審查批準。

1.2方法委托華大基因公司對16例血漿標本進行質檢和蛋白組學質譜檢測，檢測的肽段、譜圖數目、總蛋白均合格。

1.2.1主要試劑和儀器金標胰蛋白酶（trypsin gold Promega）購自北京華利世科技有限公司；質譜儀（Triple TOF 5600）來自AB CSIEX（美國）。酶聯免疫吸附 Human PDI ELISA Kit（ab229894）購自abcam公司（美國）；CPS1 ELISA Kit（ABIN813029）購自北京4A生物技術有限公司。

1.2.2檢測流程取100 μg的血漿，按蛋白質提取標準流程操作，用考馬斯亮藍法定量，12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。取100 μL蛋白，按蛋白∶酶=20∶1的比例加入胰蛋白酶，設定37℃酶解4 h，再加胰蛋白酶1次，37℃酶解8 h后對樣品進行液相分離。每個組分用除鹽柱除鹽后冷凍抽干，再分別復溶、離心后取上清5 μL，通過色譜儀進行分離。掃描的粒子信號分別記錄后合并轉化成數據。

1.3生物學信息分析用Swissprot人的蛋白質數據庫進行檢索，同時搜索人數據庫IPI_human_3.87.fasta，兩者數據庫相匹配。取兩組樣品豐度值的均數（mean）和中位數（median），計算相應的Ratio值。設定mean和median差異倍數（上/下調）均≥2.5倍為差異表達蛋白。GO注釋分別描述分子功能、細胞組分和生物過程。以KEGG Pathway為單位，經顯著性富集分析確定差異蛋白參與的生化代謝和信號轉導通路。行蛋白互作網絡分析。利用Human IGFBP7 ELISA Kit和CPS1 ELISA Kit檢測兩組血漿差異蛋白的表達。

2 結果

2.1DR與DNDR組間差異表達蛋白以均數和中位數差異倍數（DR vs DNDR）上/下調均≥2.5倍為標準，篩選出差異蛋白17個，上調11個，下調6個。見表1。

2.2GO注釋和富集分析差異表達蛋白涉及22種細胞過程，細胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process）占比最高；涉及14種細胞組分，細胞（cell）和細胞部分（cell part）占比最高；涉及5種細胞功能，結合蛋白（binding）占比最高。見圖1。

圖1 基因本體分析Fig.1 The gene ontology（GO）analysis

2.3Pathway富集分析下調最明顯的PAPLN蛋白和上調最明顯的胰島素樣生長因子結合蛋白7（Insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7）蛋白均未富集到相關代謝通路。富集到最顯著的代謝通路為丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨基甲酰磷酸合成酶1（Carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）參與其中。見圖2。

表1 DR與DNDR組間差異表達蛋白Tab.1 The differential proteomics of DR vs DNDR

2.4蛋白相互作用網絡分析HSPG2、CPS1、IGFBP7、TLN1、KRT5之間有相互作用（圖3）。

2.5血漿中IGFBP7及CPS1蛋白水平比較ELISA法檢測結果IGFBP7在DR組較DNDR組表達升高，CPS1在DR組較DNDR組表達降低，兩者差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 血漿中IGFBP7及CPS1蛋白水平比較Tab.2 Comparison of IGFBP7and CPS1 protein level in blood plasma ±s

表2 血漿中IGFBP7及CPS1蛋白水平比較Tab.2 Comparison of IGFBP7and CPS1 protein level in blood plasma ±s

注：與DNDR組比較，*均P＜0.05

組別DR組DNDR組IGFBP7（pg/mL）598.46±5.96*64.76±3.28 PS1（pg/mL）147.25±6.26*538.31±5.78

3 討論

由于生活方式、醫療保健、診斷水平等的差異，不同的研究DM患者中DR患病率有一定差異，GIUFFRE等［2］調查40歲以上DM人群DR患病率為34.1%，其中增殖性DR患病率為4.5%。DN患病率與DR程度有關，研究［3］發現87%的增殖性DR患者伴有DN。但也有部分患者僅合并DR，而不發生DN，說明兩者之間的異質性決定了臨床表現的不一致性。本研究共篩選出17個差異蛋白，以均數和中位數差異倍數作為篩選條件，避免了因樣本量少所致的數據偏倚，同時為了避免剔除有意義的蛋白，選擇差異倍數上下調2.5倍［4］。通過蛋白相互作用網絡分析發現多種差異蛋白有相互作用，說明兩組患者有不同的蛋白作用網絡，以下重點討論本研究發現的需要進一步驗證的差異蛋白。

本研究中下調最明顯的蛋白為PAPLN，但未發現有參與代謝通路。目前對PAPLN的研究較少，主要研究見于昆蟲類，發現與幾種細胞外基質成分和ADAMTS酶相互作用，對胚胎發育至關重要［5］。研究［6］發現，PAPLN水平對婦女盆腔器官脫垂發展有影響。本研究中該蛋白在DR組顯著低于DNDR組，其相互關系需進一步研究。上調最明顯的IGFBP7是一種分泌蛋白，尿IGFBP7是早期診斷腎損傷的生物標志物［7］。高血清IGFBP7水平增加了代謝綜合征和胰島素抵抗的風險，且與腰臀比、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等代謝相關參數顯著相關［8］。CAI等［9］發現，IGFBP7可抑制高糖介導的足細胞凋亡和上皮間充質轉化，表明IGFBP7可能對腎臟具有保護作用。目前較多的研究IGFBP7可能與腫瘤相關，包括膽管癌［10］、滑膜肉瘤和脂肪肉瘤［11］等。由此可見IGFBP7為多功能蛋白，本研究中DR組IGFBP7顯著上調，其機制是否與其腎臟保護作用有關需進一步研究。

HSPG2也稱為Perlecan，是一種大型單體硫酸乙酰肝素蛋白多糖，是皮質骨腔隙小管系統的關鍵組成部分。在骨細胞細胞體周圍的細胞周圍空間內，基底膜蛋白可以降低流體流動阻力，將外部刺激傳遞給骨細胞胞膜［12］。研究發現Perlecan在脂蛋白代謝中起重要作用，HSPG2-rs3767140可能與降低的低密度脂蛋白c以及DM患者的高密度脂蛋白c增加有關［13］。另外，HSPG2被鑒定為系統性硬化癥中內皮細胞損傷的標志物［14］。本研究發現HSPG2蛋白在DR組上調，GO分析示HSPG2為結合功能蛋白，并參與ECM受體相互作用的pathway，相關機制需進一步研究。

圖2 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝通路富集分析圖Fig.2 Map of pathway enrichment analysis of alanine,aspartate and glutamate metabolism

圖3 蛋白相互作用網絡分析圖Fig.3 Analysis chart of protein interaction networks

CPS1是尿素循環酶，其由碳酸氫鹽，氨和ATP形成氨基甲酰磷酸酯。CPS1缺失會降低嘧啶與嘌呤的比例，影響S期進展并誘導DNA聚合酶停滯和DNA損傷［15］。ELIKTAS 等［16］發現CPS1敲低減少細胞生長，降低與核酸生物合成途徑相關的代謝物水平。研究［17］發現甘氨酸和CPS1有相互關聯，甘氨酸與代謝健康和胰島素敏感性相關聯，因此CPS1和相關途徑在減肥維持中的可能作用。本研究中CPS1在DR組中明顯下調，pathway富集分析顯示為最顯著的代謝通路，參與丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，其在DR伴DN中的作用機制仍待研究。

綜上所述，本研究基于Label-free定量技術，并結合生物信息學，篩選出PAPLN、IGFBP7、CPS1等差異蛋白，兩組患者呈現出不同的差異蛋白表達趨勢。上述蛋白具有多種功能，且構成相互作用網絡，為篩選血漿標志物和新的干預靶點提供依據。ELISA法對IGFBP7、CPS1進行驗證，結果顯示與質譜分析結果一致，提示采用Label-free定量技術是有效和可行的，但本研究樣本量較少，且未進行全部差異蛋白的驗證，下一步工作需要擴大樣本人群，對重點研究的差異蛋白進行驗證。