雙歧桿菌聯合化療對胃癌患者腸道菌群及臨床癥狀的影響

鄭家雷 莫緩緩 楊楊 蘇方 方向 孫國平

1蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤內科（安徽蚌埠233003）；2中國科技大學附屬第一醫院老年消化科（合肥233001）；3安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科（合肥230022）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康。近年來，隨著幽門螺桿菌的根除和人們良好飲食習慣的形成，胃癌的發病率有所下降；但發病率仍高居全球腫瘤第四位，病死率位居第三位［1-2］。我國是胃癌高發國家之一，中國癌癥數據（2015年度）報告指出，我國每年胃癌預估新發病例近70萬，死亡病例約50萬，發病率和病死率在惡性腫瘤中均高居第二位［3］。化療不僅能夠有效提高進展期胃癌患者的治愈率和生存質量，而且能延長患者的生存期［4］；但是作為胃癌常見的化療藥物鉑類是是高致吐藥物，發生消化道不良反應的機率極高；常見的的臨床癥狀，如惡心嘔吐、腹脹、便秘及腹瀉等明顯影響到患者的生存質量，甚至影響化療進程。近年來研究認為化療所致的這些消化道不良反應可能與失調的腸道菌群有密切聯系［5］。因此，在胃癌患者的化療方案中能否通過加入益生菌調節腸道菌群數量變化，減少化療藥物所致的胃腸道不良反應，目前此類研究較少見。本研究通過對進展期胃癌患者化療前后腸道主要菌群數量的變化以及化療后生存質量、營養狀況和不良反應進行觀察和分析；探討雙歧桿菌對進展期胃癌患者化療后的腸道菌群數量、生存質量、營養狀況和不良反應的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2015年7月至2017年6月于蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤內科收治的82例中晚期胃癌患者作為研究對象。納入標準：（1）年齡≥18歲且≤75歲；（2）所有患者均經病理及臨床確診的進展期胃癌患者；（3）初診擬行化療，既往未行手術及化療；（4）入選前1個月內未使用過益生元、益生菌和抗生素；（5）糞便常規檢查無異常，且無腸道菌群紊亂癥狀如腹脹、腹瀉。排除標準：（1）既往曾行手術及化療；（2）有腸道菌群紊亂癥狀如腹脹、腹瀉；（3）1個月內使用抗生素；（4）有免疫系統疾病、糖尿病、肥胖等代謝疾病者；（5）伴有嚴重心腦血管疾病、全身多臟器功能衰竭及嚴重感染性疾病不能耐受化療者。

1.2研究分組納入研究對象根據隨機數字表隨機分為對照組42例及觀察組40例。對照組患者使用FOLFOX6化療方案，具體方案為：奧沙利鉑85 mg/m2靜脈滴注 2 h，d1；亞葉酸鈣 200 mg/m2，靜滴2 h，d1-2；亞葉酸鈣結束后即刻5-FU 400 mg/m2，靜脈推注，d1；5-FU 2.4 g/m2，微量泵持續靜推46 h，d1-2。2周方案，2周期后療效評估（準確記錄滴注開始和結束時間、藥物、藥量等）。化療期間均予常規止吐等對癥治療。觀察組患者予以對照組同樣化療并口服雙歧桿菌三聯活菌膠囊（上海信宜藥廠有限公司）至化療結束停止；雙歧桿菌三聯活菌膠囊用法用量參照說明書予以2粒，口服，2次/d。所有患者均接受至少2個周期化療。

1.3主要試劑及儀器主要試劑：大便基因組提取試劑盒（TIANGEN）、Taq plus PCR Master-Mix、SYBR Green I Mastex、引物合成（上海生工）。主要儀器：紫外分光光度計（日立公司），實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）、低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）、電子天平（國產）、移液器（德國Eppendorf公司）。

1.4研究方法（1）標本采集：所有研究對象化療前后均使用無菌凍存管留取中段糞便1次，3 g以上，凍存于-20℃冰箱。（2）大便標本DNA提取：取0.5 g糞便，使用北京天根生化科技有限公司的細菌DNA提取試劑盒提取糞菌DNA。提取的大便菌群DNA繼續放入-20℃冰箱內凍存。（3）引物設計與合成：參照既往文獻和相關報道，應用Gene Bank數據庫比對，篩選出特異性強的引物信息，由上海生工生物公司合成，見表1。（4）待測大便樣品：16S rDNA的定量分析，提取的糞菌的DNA分別進行6種細菌的16S rDNA熒光定量PCR，每次實驗同時設ddH2O代替DNA模板的陰性試驗和標準品校正，每個樣品均同時做2個平行復孔。（5）反應體系及擴增條件：優化反應體系及擴增條件，進行SYBR Green為熒光染料的實時定量PCR。見圖1。

表1 腸內6種目標菌群的特異性引物序列Tab.1 Sequences of specific primers for seven target intestinal flora

1.5統計學方法數據輸入SPSS 16.0統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差表示，應用兩獨立樣本t檢驗法比較組間差異；計數資料用例數表示，應用χ2比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1納入研究病例的一般資料對照組及觀察組在性別比例、年齡、體質量指數、家族史等基線資料間差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

圖1 熒光定量PCR溶解曲線Fig.1 Fluorensece quantitive PCR dissolution curve

2.2 雙歧桿菌對胃癌患者化療前后腸道菌群的影響對照組胃癌患者化療后腸道糞便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數量明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），而擬桿菌菌數量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；腸桿菌、腸球菌及葡萄菌組間差異無統計學意義。見表3。

表2 納入研究病例的一般資料Tab.2 General Information of subjects included in study x±s

觀察組胃癌患者化療后腸道糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌數量較前增加，差異有統計學意義（P＜0.05），而葡萄球菌數量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；腸桿菌、腸球菌及擬桿菌組間差異無統計學意義。見表3。化療后觀察組胃癌患者大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數量較對照組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05），而擬桿菌及葡萄球菌數量明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 雙歧桿菌對胃癌化療患者腸道菌群的影響Tab.3 Influence of bifidobacterium on intestinal flora in patients with gastric cancer undergoing chemotherapy x± s，LogN/g濕便

2.3 雙歧桿菌對胃癌患者化療療效的影響在化療療效方面，化療后觀察組40例胃癌患者中4例完全緩解，13例部分緩解，14例穩定，9例進展，近期有效率（CR+PR）為42.5%；對照組42例胃癌患者中3例完全緩解，13例部分緩解，16例穩定，10例進展，近期有效率（CR+PR）為38.1%；兩組間有效率的差異無統計學意義（P＜0.05）。

2.4 雙歧桿菌對胃癌患者化療后不良反應的影響在消化道不良反應方面，化療后觀察組胃癌患者食欲減退、腹脹、腹瀉及便秘的發生率均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。兩組間惡心、嘔吐及腹痛組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。觀察組未出現3級以上嘔吐及腹瀉，而對照組分別有3例。

2.5 雙歧桿菌對胃癌患者化療后實驗室指標的影響化療后觀察組胃癌患者肝功能損害、前白蛋白減少及大便隱血的發生率均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；但兩組間白細胞減少、貧血、血小板減少及白蛋白減少的發生率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

2.6 雙歧桿菌對胃癌患者生存質量及營養狀況的影響化療后觀察組胃癌患者生存質量評分明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；化療后觀察組胃癌患者營養評估得分及營養不良的發生比例均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表4 雙歧桿菌對胃癌患者化療后胃腸道不良反應的影響Tab.4 Influence of bifidobacterium on gastrointestinal adverse reaction with gastric cancer undergoing chemotherapy例

表5 雙歧桿菌對胃癌患者化療后實驗室指標的影響Tab.5 Influence of bifidobacterium on laboratory indicators with gastric cancer undergoing chemotherapy 例

表6 雙歧桿菌對胃癌患者化療后生存質量及營養狀況的影響Tab.6 Influence of bifidobacterium on quality of life and nutritional status with gastric cancer undergoing chemotherapy x±s

3 討論

中國癌癥數據（2015年度）報告顯示我國胃癌新發病例和死亡病例均占全世界的40%以上［3］；由于早期胃癌診斷十分困難，大部分胃癌患者臨床確診時已處于中、晚期，目前國內新診斷胃癌患者90%左右為進展期［6］。以化療、放療、靶向治療結合的綜合治療在一定程度可以延長患者生存期，改善其生活質量；另一方面可以提高進展期胃癌的治愈率［7］。鉑類和5-FU等均是胃癌化療的基礎藥物，且兩者聯合應用具有顯著的協同作用，但是聯合化療的療效和獲益已達到一定極限［8］，因為胃癌聯合化療的不良反應，如腹瀉、便秘、腹脹、骨髓抑制及惡心嘔吐等，輕則影響患者生存質量、加重或導致營養不良，重則影響到患者化療進程甚至危及生命［9］。

腸道內益生菌群在體內具有潛在抑制結直腸癌發生、發展的作用［10-11］。目前沒有相關研究提示胃癌的發生、發展與腸道中的某特定菌群有直接或間接的關系，但有研究［12］認為健康受試者大便菌群與胃癌患者有差異，說明化療前胃癌患者的腸道菌群已屬紊亂狀態。STRINGER等［13］研究發現接受不同化療方案出現胃腸道不良反應的不同惡性腫瘤患者的糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌的數量均明顯下降。本研究也發現，化療后的對照組雙歧、乳酸桿菌的數量減少，而擬桿菌數量上升，表明FOLFOX6方案可抑制胃癌患者腸道有益菌群的生長，促進條件菌群的生長，導致腸道菌群紊亂加重。而陳春華等［14］的研究結果顯示，失調的腸道菌群會導致腹瀉、嘔吐、惡心等并發癥，甚至會出現嚴重的腸菌移位感染，常規的止吐及止瀉治療效果有限。但本研究結果顯示兩組間惡心、嘔吐及腹痛的發生率差異無統計學意義，且觀察組未出現3級以上嘔吐及腹瀉，而對照組分別有3例。提示胃癌使用FOLFOX6方案化療同時額外補充益生菌能減少3級以上消化道不良反應發生的趨勢，此結論有待擴大樣本量進一步證實。

本研究在觀察組胃癌患者化療過程中全程予以雙歧桿菌乳桿菌常規劑量口服；化療后觀察組患者腸道糞便中雙歧桿菌較化療前有所升高，葡萄球菌則明顯降低；且觀察組的雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯高于對照組，而擬桿菌及葡萄球菌數量則明顯減少。研究結果顯示補充外源性雙歧桿菌乳桿菌能夠糾正胃癌患者化療所致的腸道菌群失調，提示對胃癌患者化療所致的腸道菌群紊亂具有預防作用。雙歧桿菌是一種具有抗腸道酶類消化和抗胃酸作用的重要益生菌，通過其細胞壁黏附于腸黏膜上皮細胞，并調節腸道黏膜免疫反應；一方面維護了腸黏膜穩定的屏障功能，另一方面保證腸黏膜通透性處于正常水平［15］。許春進等［12］在胃癌患者化療過程中加用益生菌，可糾正腸道菌群紊亂，降低消化道不良反應的發生率，且未增加明顯其他不良反應。

本試驗在胃癌患者化療全程中常規劑量口服雙歧桿菌乳桿菌，在消化道不良反應方面，化療后觀察組患者食欲減退、腹脹、腹瀉及便秘的發生比例明顯低于對照組；提示胃癌患者化療全程中額外補充口服雙歧桿菌三聯活菌膠囊可通過調節腸道菌群失調降低化療所致的消化道不良反應。在生存質量及營養狀況方面，化療后觀察組胃癌患者生存質量評分、營養評估得分及營養不良的發生比例均明顯高于對照組。因此，胃癌FOLFOX6化療過程中輔以雙歧桿菌可以減少患者胃腸道不良反應，改善患者的生存質量；并且可以提高患者對化療的耐受性，促進患者完成化療周期。MARTIN等［16］研究認為增加腸道內益生菌雙歧和乳酸菌數量，可促進腸粘膜屏障的恢復，通過增加益生菌群數量增強其抗炎作用，同時減少條件菌群如腸桿菌的數量降低內毒素的產量，從而減輕肝功能損害。本研究在實驗室指標方面，化療后治療組胃癌患者肝功能損害、前白蛋白減少及大便隱血的發生率均明顯低于對照組；提示雙歧桿菌乳桿菌在胃癌患者化療過程中可通過調節患者腸道菌群改善化療導致的肝功能損害、前白蛋白合成以及腸道黏膜損傷。在生存質量及營養狀況方面，研究結果顯示化療后治療組胃癌患者的生存質量及營養評分優于對照組；考慮主要原因可能一方面與患者消化道不良反應減少而攝入增加有關，另一方面與腸道菌群紊亂的糾正有關，因為人體很多必須氨基酸的合成及脂質的吸收均與腸道菌群有關。

綜上所述，本研究結果表明FOLFOX6方案可抑制胃癌腸道菌群的正常生長，進一步降低腸內益生菌群數量，加重益生和條件菌群的比例失調；口服雙歧桿菌三聯活菌膠囊可增加化療過程中胃癌患者腸道內益生菌數量，降低條件菌數量，從而預防和糾正菌群失調。由于本實驗樣本量小，隨訪時間短、且未進行多中心臨床研究，結果一定程度上存在偏倚，研究結論還待進一步重復驗證。