NGS技術在非梗阻性無精子癥和少精子癥患者Y染色體AZF區檢測中的應用*

高玲霞 王 玲 蔡 楊 馬旭輝 李建波 王 珺

空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心（陜西西安 710038）

Tiepolol等于1976年首次提出了在人類Y染色體長臂1區1帶(Yq11)存在著精子生成基因,并將其命名為無精子因子 (azoospermia factor,AZF)[1]。1996年Vogt進一步將AZF區劃分為3個區域,并命名為AZFa、AZFb和AZFc區[2]。AZF區的各亞區示意圖見圖1[3],AZFb和AZFc區由擴增子家族blue(b),turquoise(t),green(g),red(r),yellow(yel),gray(g)亞區組成。其中AZFa區主導精母細胞的增生，缺失多表現為唯支持細胞綜合征和無精子癥；AZFb區缺失病理診斷為生精過程阻滯；AZFc區缺失可造成無精子癥，也可造成極度少精子癥。2003年Repping等的研究證實了AZFc區部分缺失的存在,并認為其與精子生成障礙相關[4]。目前的研究發現AZFc區拷貝數變化(copy number variations,CNV)發生率最高并且種類繁多，它們和男性精液質量之間的關系說法不一[5-11]，目前AZFc區CNV與精子生成障礙之間的關系是男性不育研究中新的熱點問題[12，13]，檢測AZF缺失類型的方法有 3 種，液相芯片[14，15]、Real-time PCR[16]和 STS-PCR。這些方法由于檢測的序列標簽位點(sequence-tagged site,STS)有限，因此僅能通過STS位點缺失情況模糊推斷AZF區缺失類型，不能明確缺失區域的具體范圍。對于未知的缺失類型以及STS位點不完全缺失的情況會出現漏檢，而且不能檢測微重復。近年來，一種基于選定區域捕獲結合高通量測序技術被證明在染色體拷貝數變異檢測中具有傳統方法所不具備的諸多優勢，該技術特有的使用NGS下一代基因測序技術檢測雜交的探針方式使其在染色體微小缺失診斷中尤為適合，并且可實現在單管中覆蓋相比STS-PCR高出10倍的檢測位點[17]。本研究首次嘗試將該技術應用Y染色體AZF區的CNV檢測中，研究AZFc區拷貝數的變化與男性精液質量之間的關系。

圖1 AZF區示意圖

資料與方法

一、材料

收集2016年7-8月在唐都醫院生殖醫學中心就診的53例診斷為非梗阻性無精癥或少精癥為實驗組 (精子濃度＜5×106/mL)，另選取219例精子數目正常的男性為對照組。所有樣本經染色體核型分析，性激素檢測，慢性病，睪丸惡性腫瘤和精索靜脈曲張B超檢測。

二、方法

（一）STS-PCR檢測

外周血DNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒 (Qiagen公司，德國)，并經 Qubit 2.0 Fluorometer(Life公司，美國)測定濃度及純度。STS-PCR檢測使用深圳亞能Y染色體微缺失檢測試劑盒。

（二）選定區域捕獲和NGS技術檢測流程

外周血DNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒(Qiagen公司，德國)。所提取的DNA用選取的152個特異性探針序列片段進行探針雜交，連接酶對雜交上的探針進行連接，經過PCR擴增后，文庫就建成了。通過NGS得到這152個位點的序列計數，這些序列計數反映了原始樣本AZF相應區域的DNA信息，通過這些信息可以得出Y染色體AZF區拷貝數變化情況。每批次檢測均同時包含正常男性DNA質控品和空白對照。

三、統計學處理

數據統計采用SPSS19.0軟件(IBM公司，美國)，X2檢驗分析實驗結果。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、STS-PCR檢測結果

實驗組中檢出6例AZF缺失，檢出率為11.32%（6/53）。其中病例1為AZFa區完全缺失，病例2為AZFb區完全缺失，病例3,4,5為AZFc區完全缺失，病例6為AZFb+c區完全缺失。對照組中未檢出STSPCR缺失型。STS-PCR方法檢測的STS位點見表1，該6例STS缺失型患者PCR檢測結果見圖2。

表1 STS-PCR檢測位點

圖2 6例STS缺失型患者的電泳結果

二、NGS檢測結果

對于上述STS-PCR方法檢測出的6例AZF缺失患者，NGS技術檢測結果與STS-PCR檢測結果一致，檢出率100%。NGS技術對這6例AZF缺失患者檢測結果見圖3。

實驗組經NGS技術檢出率為52.83%（28/53），對照組中NGS技術檢出率為25.57%（56/219）。這其中包括了STS-PCR方法未檢測出的12種異常CNV，包括AZFc區的3種部分缺失，3種重復和6種缺失伴隨重復三大類。NGS技術檢測出的AZF區CNV在無精子癥、少精子癥和正常精子數目組中的分布見表2。其中gr/gr缺失在實驗組和對照組間具有統計學差異（P=0.022），AZFc區完全缺失在實驗組和對照組間具有統計學差異（P=0.007）。其他CNV在實驗組和對照組間沒有統計學差異。

圖3 6例STS缺失型患者的NGS檢測結果

討 論

一、選定區域捕獲結合高通量測序技術是進行AZF區域基因重排檢測的一種精確可靠技術

本次研究結果發現對于STS-PCR方法檢測的六個經典位點的缺失，NGS技術檢測結果與STS-PCR檢測結果一致，檢出率100%。對于STS-PCR方法檢測出的陰性樣本，NGS技術發現了STS-PCR未發現的異常，使檢測異常范圍更大。

目前由于STS-PCR方法采用有限的STS位點進行檢測，對于未知的缺失類型或缺失區域未涉及到所用STS位點的情況，則會出現偏差和漏檢，對于gr/gr等STS位點不完全缺失的情況也會出現漏檢，且不能檢測微重復，并且STS-PCR方法僅能通過STS位點模糊推斷AZF區域缺失類型，不能明確缺失區域的具體范圍、大小、涉及的基因信息。該技術的這些缺點使AZF區的CNV檢測在臨床上還停留在篩查的階段，不能為臨床提供準確的報告。本研究是首次利用高通量測序技術進行Y染色體AZF微缺失檢測，采用了覆蓋整個Y染色體AZF區及SRY、ZFY等內參基因區的寡核苷酸探針，利用探針雜交捕獲的分子實驗技術結合高通量測序技術，并通過生物信息分析手段，最終判定AZF區的微缺失狀況。該檢測技術基于探針的覆蓋性好、雜交捕獲的穩定性高、高通量測序及數據分析的信號值精確等優勢，完美的解決了上述傳統PCR技術存在的缺陷，可以極大的提高臨床診斷的準確率，避免誤診引起的后續不必要的檢查及治療，對節省病人就診花銷和減少醫院資源浪費有重要意義。另外，該技術由于其檢測的精準性，對男性不育的臨床研究也有重要的促進意義。

表2 AZF區異常類型在無精子癥少精子癥和正常精子數目組中的分布

二、gr/gr缺失是影響男性精子生成的一種因素

本研究發現gr/gr缺失與男性生精障礙有關。這與Bansal K[8]，Motovali-Bashi[18]，Nailwal[19]等的研究結果相一致。目前學者認為gr/gr-DAZ1/DAZ2缺失與男性生精障礙有關，gr/gr-DAZ3/DAZ4缺失與男性生精障礙無關[20，21]。這提示我們在今后的研究中對gr/gr缺失型的種類分類研究有助于探討gr/gr缺失影響精子生成的機制。另有研究證明AZFc區基因的不同劑量是影響精子數目的一個因素[22]，gr/gr缺失，b2/b4多次重復的患者精子數目較gr/gr缺失患者少，兩者具有統計學差異[23]。這提示我們在今后的研究中也應該關注AZFc區的重復類型。有研究認為gr/gr缺失會在子代中擴大缺失區域，形成AZFc區的全部缺失從而導致后代不育[24，25]。因此在行輔助生殖技術助孕前，對存在gr/gr缺失的患者進行遺傳咨詢，可以避免后代的遺傳風險。

三、AZFc區其他的CNV與男性生精障礙的關系

b2/b3缺失是除gr/gr缺失外，AZF區CNV中占比最高的，但本次研究結果表明b2/b3缺失與男性生精障礙無關，其它的研究結果也支持該結論[9，26，27]。

本次研究中發現一例精液正常的患者b1/b3缺失，由于b1/b3缺失的發生率極低[27],其與男性生精障礙的關系有待進一步研究。

另外發現的6例gr/gr缺失，b2/b4重復也與男性生精障礙無關。KazukiSaito等[28]研究也發現在56例生精障礙中有1例存在gr/gr缺失，b2/b4重復1次的患者，65例正常精液質量組中存在兩例這種CNV，兩組之間也無統計學差異。ReppingS等[29]推斷是由于gr/gr缺失后b2/b4重復穩定了AZFc區基因拷貝數目，因此對生精功能不造成影響；本次研究發現gr/gr重復不會導致男性生精障礙，但KazukiSaito等[28]的研究發現gr/gr重復與男性生精障礙有關。本研究還首次發現了6種AZFc區的 CNV：b2/b3倒位，g1/g3重復；b2/b3重復；b2/b3缺失，b3/b4重復；b1/b3缺失，gr/gr重復；p5/p1遠端缺失，gr/gr重復；b1/b3缺失，b2/b4重復。雖然本次研究發現他們和男性生精障礙無關，但由于存在這些CNV的患者數目較少，未來仍需更進一步的研究。

綜合本研究的結果，我們認為基于選定區域捕獲結合高通量測序技術較STS-PCR方法有更高的檢測靈敏度和分辨率，是進行AZF區基因重排分析檢測的一種精確可靠技術。另外gr/gr缺失和AZFc區完全缺失與精子生成相關。目前關于AZF區CNV與男性生精障礙、睪丸表型、睪丸腫瘤等的關系的研究相對較少，隨著高通量測序技術的臨床化應用和其他相關研究方法的不斷革新，數據的進一步積累，相信我們終將揭示他們之間的關系，更準確地指導男性不育的遺傳咨詢。