基于固相萃取膜盤技術分離富集海水中軟骨藻酸

王九明 陳軍輝 何秀平 李曉彤 吳丹妮 鄭曉玲 王小如

摘?要?軟骨藻酸（Domoic acid， DA）是由海洋硅藻產生的一種可致人記憶缺失的親水性毒素，對海產養殖業以及人類健康造成嚴重威脅。本研究建立了一種高效富集海水中微量DA的新方法，結合高效液相色譜-紫外檢測/質譜分析實現了養殖海水中DA的檢測。利用磺化苯乙烯-乙烯基苯共聚物材質的固相萃取膜盤，對經甲酸酸化處理的海水樣品中的DA進行富集、凈化;采用反相C18色譜柱分離DA，以含2.0 mmol/L乙酸銨和0.1%（V/V）甲酸的90.0%（V/V）乙腈為流動相，紫外檢測波長為242 nm。在最佳實驗條件下，對海水中DA的富集倍數可達2000倍，平均回收率89.3%，具有良好的精密度（相對標準偏差（RSD）≤4.0%）;海水中DA的檢出限（S/N=3）為2.5 ng/L， 使高效液相色譜-紫外檢測能滿足實際海水中DA測定的靈敏度要求。采用本方法對中國東海部分海域海水中的DA進行了檢測，在兩個站位海水樣品中檢出DA，含量最高可達2.7 μg/L。本方法操作簡單、靈敏度高，是近海養殖海水環境中DA測定的有效方法。

關鍵詞?軟骨藻酸; 盤式固相萃取; 海水; 高效液相色譜

1?引 言

當前，海洋環境污染日趨嚴重，赤潮現象頻頻發生。由赤潮生物暴發所產生的大量生物毒素通過食物鏈進入人體，進而威脅人類健康[1]。軟骨藻酸（Domoic acid， DA）是一種具有神經毒性的氨基酸類化合物，是記憶喪失性貝毒的主要成分，主要由海洋硅藻-擬菱形藻（Pseudo-nitzschia）產生[2]。DA能夠引起海洋哺乳動物及人類中毒， 甚至死亡[3～8]。鑒于其對人類健康存在的潛在威脅，國際食品法典委員會（CAC）規定貝類中DA的安全限量為20.0 μg/g[9]，美國、加拿大、歐盟、日本和中國等國家相繼執行此國際標準。

近年來，有害擬菱形藻及其產生的DA在全球海域的分布范圍逐漸擴大[10，11]。本格拉上升流海域檢測到DA的最高濃度達180 ng/L[12]; 在法國北海海域近岸海水中DA濃度在102～263 ng/L之間[13]。2015年5～8月在美國北部西海岸暴發的一次大規模產毒擬菱形藻藻華事件， 造成大量海豚、海獅及海鳥死亡，在該海域螃蟹等海產品中檢出高濃度DA，已超出其安全限量范圍[14]; 2017年中國近海發現能夠產生DA的擬菱形藻[15]，南海海域多個批次海產品中也檢出DA，在扇貝中的累積量高達10.1 μg/g[16]。DA對海產養殖業帶來了嚴重威脅，因此需對DA進行有效檢測與監測。目前，DA的檢測方法主要有生物分析法[17]、高效液相色譜法[18]、熒光檢測法[19]、質譜法[20]、酶聯免疫分析法[21]和毛細管電泳法[22]等。其中，高效液相色譜法及高效液相色譜-質譜聯用技術具有準確性高、穩定性好的特點，是目前測定DA的最佳方法。海水是海洋養殖生物的棲息地，海水中毒素的濃度水平直接影響海產品的食用安全，而對海洋養殖環境水體中毒素的有效檢測是海產養殖安全管理的前提。由于海水中DA含量較低，且DA是一種極性較大的親水性物質，對高鹽海水基質中的DA直接進行儀器檢測和快速富集比較困難。無定型TiO2[23]、分子印跡聚合物[2，5]、磁性材料[24]等常被用作吸附劑，對海水中的DA進行分離富集，然而這些吸附材料還未實現產業化生產，無法進行廣泛推廣應用。采用商品化C18固相萃取柱可實現海水中DA的富集，但富集倍數僅20倍[25]; 利用商品化的反相C18固相萃取膜盤對海水中的DA進行富集時，富集倍數為20倍，回收率達90.0%以上，然而通過增加海水上樣量提高富集倍數時，方法的回收率明顯下降[26]，說明該方法富集倍數和效率低，不適于海水中痕量DA的高效富集。因此，急需開發對海水中痕量DA分離效果好、富集倍數高，并且能夠推廣應用的新富集方法。

固相萃取膜盤技術由于具有盤片上吸附劑分布均勻、超低溶出及動力學高效率（高流速不會影響回收率）的特點，在大體積水樣處理中具有傳統SPE小柱無法比擬的優勢，已成為環境水體微量污染物快速富集、凈化的高效方法[26，27]。本研究采用磺化苯乙烯-乙烯基苯（SDB-RPS）共聚物材質且對極性化合物有高效吸附性的固相萃取膜盤，結合高效液相色譜-紫外檢測/質譜分析法，建立了一種針對海水中痕量DA進行高效富集測定的新方法，并將其應用于東海海域海水樣品中DA的測定。

2?實驗部分

2.1?儀器、試劑與藥品

1220型高效液相色譜儀、6320型電噴霧離子阱質譜儀（美國Agilent公司）; FA1104 型電子天平（上海精天電子儀器廠）; Milli-Q超純水處理系統（美國Millipore公司）; KQ-400KDE 型高功率數控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）; RE100-pro旋轉蒸發儀（北京大龍公司）; 磺化苯乙烯-乙烯基苯（SDB-RPS）固相萃取膜盤、C18固相萃取膜盤（47 mm，美國3M公司）; 5 TC-C18 （2） 色譜柱（150 mm×4.6 mm）、 Poroshell 120 色譜柱（100 mm× 3.0 mm）、ZORBAX 300 SB-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm， 3.5 μm）均購于美國Agilent公司; 0.22 μm 混合纖維膜（上海市新亞凈化器件廠）。

甲酸（色譜純）、乙酸銨（優級純）（瑞士Fluka公司）; 甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）; 丙酮、異丙醇（色譜純，德國Merck公司）; DA 標準品（美國Sigma公司）; 實驗用水為Milli-Q超純水（18.2 ?MΩ cm）。

2.2?高效液相色譜-質譜條件

色譜條件： Agilent 5 TC-C18 （2） （150 mm×4.6 mm， 5.0 μm）色譜柱，90.0%（V/V）乙腈（含2.0 mmol/L 乙酸銨+0.1%甲酸）為流動相，等度洗脫，柱溫35℃，流速1.2 mL/min，二極管陣列檢測器（DAD）檢測波長242 nm，進樣量20.0 μL。與質譜聯用分析時，由HPLC流出進行分流，使得進入質譜的流動相流速為0.3 mL/min。

質譜條件： 電噴霧正離子模式檢測，全掃描范圍為m/z 100～500，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10.0 L/min，噴霧氣壓力206.8 kPa。二級質譜分析選擇DA的母離子為[M+H]+ （m/z 312.2），生成特征碎片離子m/z 266.2、294.2、248.2。

2.3?樣品前處理方法

取2.0 L海水樣品，經孔徑為0.22 μm的濾膜過濾去除懸浮顆粒物，加入8.0 mL甲酸進行酸化處理，然后進行固相萃取膜盤富集。首先對SDB-RPS固相萃取膜盤進行活化處理： 加入10.0 mL丙酮，使丙酮溶液通過膜片浸泡30 s，抽干; 加入10.0 mL異丙醇，使異丙醇溶液通過膜片浸泡30 s，抽干; 加入10.0 mL甲醇，待甲醇溶液只剩約1.0 mL時，加入10.0 mL水，待膜片上保留約1.0 mL水時，固相萃取膜盤完成活化。取酸化后的海水樣品，以6.0 mL/min的流速過固相萃取膜盤，加入20.0 mL水對膜盤進行淋洗，抽干; 使用20.0 mL 80.0%（V/V）甲醇分2次對DA進行洗脫，合并洗脫液，采用旋轉蒸發儀在50℃下將洗脫液進濃縮至干，用1.0 mL 乙腈-水（1∶19， V/V）復溶，轉移到進樣小瓶中，待測。

3?結果與討論

3.1?色譜條件的優化

由文獻[28，29]可知，DA有較強的紫外吸收，為了能獲得較高的靈敏度，在210～400 nm范圍內進行掃描。由DA的紫外吸收光譜圖（圖1A）可見， DA的最大吸收峰在242 nm處，因此選擇242 nm作為DA的最佳檢測波長，這與文獻[21]結果一致。反相C18色譜柱常用于DA的HPLC分離分析[5，30]; 考慮到DA是一種極性較大的弱酸性化合物，在反相C18色譜柱上保留較弱，本研究以水-乙腈混合液為流動相，對3根同一廠家不同碳載量的C18色譜柱（5TC-C18（2）、Poroshell 120、ZORBAX 300 SB-C18色譜柱）進行了比較，結果表明，Agilent 5 TC-C18（2） 色譜柱的分離效果最理想，分離度高， 并且峰形尖銳對稱，說明不同的色譜柱對海水中的DA分離結果差異較大，選擇碳載量相對較低的C18柱尤為關鍵。在最佳色譜分離檢測條件下，對添加DA標準品的海水樣品進行了分析，色譜圖如圖1B所示，DA色譜峰尖銳對稱，與海水中的干擾組分達到了良好分離，可以準確積分其峰面積， 進而對海水中DA進行定量測定。

3.2?前處理條件的優化

3.2.1?固相萃取膜盤的比較優化?C18固相萃取小柱和膜盤已成功用于水體中DA的有效富集[27，28]。鑒于DA是一種親水性較強的極性化合物，而SDB-RPS固相萃取膜盤對環境水體中強極性化合物有良好的富集效果，所以本研究采用空白海水添加DA標準品為陽性樣品，對C18固相萃取膜盤和SDB-RPS固相萃取膜盤富集海水中DA的效率進行了比較。結果表明， SDB-RPS固相萃取膜盤對海水中DA的富集效率是C18固相萃取膜盤的1.3倍。本研究選取SDB-RPS固相萃取膜盤用于海水中DA的富集。

3.2.2?海水酸化條件的優化?DA是一種弱酸性物質，在水溶液中易發生電離，不利于DA在固相萃取膜盤上富集。為提高固相萃取膜盤對海水中DA的富集效率，在海水樣品中加入適量酸，通過抑制其電離，可提高方法的富集效率。以不添加甲酸的加標海水樣品為對照，對海水樣品添加甲酸的量進行了優化。如圖2所示，在對照海水樣品中未檢測到DA，說明在海水樣品未經酸化處理的條件下，固相萃取膜盤對海水中DA沒有明顯的吸附作用。在加入0.2%～0.5%甲酸酸化的加標海水樣品中，均檢測到了DA，說明固相萃取膜盤對酸化后的海水中DA有明顯的富集作用; 而加入0.4%甲酸酸化的海水樣品，固相萃取膜盤對其DA吸附效率最高。最終選擇加入0.4%甲酸對海水樣品進行酸化處理。Wang等[31]也采用添加0.4%甲酸對海水樣品進行酸化處理，以提高C18固相萃取小柱對海水中DA的富集效果。

3.2.3?洗脫劑優化?在固相萃取前處理過程中，選擇合適的洗脫劑對于提高方法的回收率和重復性至關重要。考察了20.0 mL 20.0%、50.0%、80.0%、90.0%、100.0%甲醇作為洗脫劑時，對SDB-RPS固相萃取膜盤上吸附的DA的洗脫效果。如圖3所示，采用80.0%甲醇作為洗脫劑時，洗脫效果最好。

3.2.4?海水去除懸浮顆粒物濾膜的優化?海水在進行固相萃取膜盤處理之前先經過微孔濾膜進行過濾，以除去海水中懸浮固體顆粒物，減小基質對固相萃取膜盤的阻塞和對目標化合物吸附效率的影響。孔徑為0.45和0.22 μm的濾膜常用于去除海水中的懸浮固體顆粒物，本實驗對這兩種孔徑的濾膜進行了比較，結果表明，選用孔徑為0.22 μm的濾膜比孔徑為0.45 μm的濾膜具有更好的效果（1.2倍）。

3.3?方法學考察

本研究采用高效液相色譜-紫外檢測、外標法對海水樣品中的DA進行定量分析，以峰面積對目標化合物的濃度做標準曲線。DA濃度在0.01～4.0 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數R2=0.9998。在空白海水中加入DA標準溶液，按照2.3節方法進行處理，以逐漸降低空白加標海水中DA濃度的方法確定方法的檢出限。將信噪比（S/N）為3時所對應DA在海水中的質量濃度為檢出限（LOD），方法的LOD為2.5 ng/L。在文獻[18]中采用C18固相萃取膜盤結合高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定海水中DA的方法， 檢出限為20.0 ng/L，而本方法采用高效液相色譜紫外檢測具有更好的靈敏度，主要得益于SDB-RPS固相萃取膜盤能對大體積海水樣品中的DA進行高效富集。

取同一濃度加標海水樣品5份，采用本方法測定DA峰面積的RSD為5.4%，保留時間的RSD為0.02%，表明本方法重復性良好。采用2.0 L空白海水進行DA標準添加實驗，海水中分別添加20.0、80.0和160.0 ng/L的DA，采用本方法進行測定，回收率分別為90.1%、86.3%和91.6%，RSD（n=3）分別為1.7%、4.0%和0.2%，說明本方法可用于實際海水樣品中DA含量的測定。C18固相萃取膜盤法對海水中DA的富集倍數≈20時，回收率達到85.0%; 但是，通過進一步增加海水上樣量而提高富集倍數時，回收率明顯下降。本研究發展的SDB-RPS固相萃取膜盤富集法，對海水中DA的富集倍數高達2000，較文獻[23]方法的富集倍數提升了100倍，回收率為86.3%～91.6%，表明本方法可用于海水中DA的高效富集。

3.4?實際海水樣品分析

海水中DA的定性鑒別過程如下： 首先對DA標準溶液和經固相萃取膜盤處理的海水樣品進行HPLC-DAD-MS檢測，通過比較DA標準溶液和海水樣品中目標化合物的紫外檢測色譜圖（圖 4）可見，海水樣品檢出化合物保留時間與DA標準品保留時間一致，并且DAD全波段掃描獲得的紫外吸收光譜圖也一致，即初步說明此化合物是DA。應用本方法對從東海4個站位采集到的海水樣品進行了檢測，其中的兩個站位的海水樣品中檢出DA。

DA的相對分子質量為311.2，電噴霧一級質譜分析可以產生特征離子為m/z 312.2，根據質量數確定此離子為[M+H]+。以 m/z 312.2 [M+H]+為母離子，對DA標準品溶液和海水樣品進行二級質譜分析，可見海水中目標化合物（圖5B）與DA標準對照品的二級質譜特征離子（圖5A）一致，3個豐度較高的碎片離子均為m/z 266.2 [M+H-HCOOH]+，m/z 248.2 [M+H-HCOOH-H2O]+ 和m/z 294.2 [M+H-H2O]+，進一步確定海水中檢測到的化合物為DA。

HPLC-DAD對海水中DA測定結果表明，兩個站位海水樣品中DA的濃度分別為0.1和2.7 μg/L， 說明我國東海部分海域的海洋生物面臨一定程度的DA污染威脅。這是首次從我國東海海水中檢測到溶解態DA。與威尼斯Lagoon湖及周邊海域環境水體中的DA含量（1.5～16.2 ng/L）[32]?對比可知，本方法測得的東海部分海域海水中DA濃度明顯偏高。海水中高濃度DA的發現進一步證明該海域存在大量產DA毒素的浮游植物，這也增加了該海域海洋生物DA的污染風險。因此，加強對該海域DA含量的監測，避免有毒有害藻華的爆發以及藻毒素中毒事件的發生，對于保護近海環境、海洋漁業和養殖業健康發展、海產品安全具有重要意義。

4?結 論

建立了一種基于固相萃取膜盤富集的高效液相色譜-紫外檢測/質譜測定海水中溶解態DA的新方法。與傳統的固相萃取小柱法相比，固相萃取膜盤法的海水樣品上樣速度快、富集倍數高、不易堵塞，適于在調查船對海水中微量DA的現場快速富集。利用SDB-RPS固相萃取膜盤對2.0 L海水中微量DA進行快速富集，富集倍數高達2000倍，方法回收率和重復性良好，使常規高效液相色譜-紫外檢測法達到了測定實際海洋環境水體中DA的靈敏度要求。本研究也為大體積遠洋環境水體或極地海水中痕量有機物現場快速富集方法的建立提供了新思路，為解決海水樣品體積大、不易在調查船上長期冷凍保存和運輸的難題提供了新方法。

References

1?SHEN Hui-Hui， CHEN Jun-Hui， XU Xiu-Li， PAN Lei， HE Xiu-Ping， WANG Xiao-Ru. Chinese J. Anal. Chem.， 2018， 46（6）： 985-992

申慧慧， 陳軍輝， 徐秀麗， 潘 蕾， 何秀平， 王小如. 分析化學， 2018， 46（6）： 985-992

2?He X P， Chen J L， Wang J T， Tan L J. J. Chromatogr. A， 2017， 1500： 61-68

3?Kathi A L， Alicia H， Barbie H， Padraig D， Sara S， Nina I， David J M， Frances M D G. Harmful Algae， 2018， 79： 53-57

4?Cook P F， Reichmuth C， Rouse A A， Libby L A， Dennison S E， Carmichael O T， Kruse-Elliott K T， Bloom J， Singh B， Fravel V A， Barbosa L， Stuppino J J， Van Bonn W G， Gulland F M D， Ranganath C. Science， 2015， 350（6267）： 1545-1547

5?AoJ J， Gu J P， Yuan T， Li D， Ma Y N， Shen Z M. Chemosphere， 2018， 199： 98-106

6?Saima A F， Awan S A， Ling S M， Wang R Z， Wang S H. Algal Res.， 2017， 24： 97-110

7?CHU Ying-Qian， XIE Ying， CHEN Xi， CUI Han， ZHANG Xiao-Lin， HUANG Da-Liang. Phys. Test Chem. Anal. Part B， 2015， 51（10）： 1396-1399

褚瑩倩， 謝 瀛， 陳 溪，崔 晗， 張曉林， 黃大亮. ?理化檢驗-化學分冊， ?2015， 51（10）： 1396-1399

8?Zhang W M， Lin M X， Tong P， Lu Q M， Zhang L. J. Chromatogr. A， 2016， 1443： 54-61

9?CODEX STAN 292-2008， Standard for Live and Raw Bivalve Molluscs （2015 revised version）， Codex Alimentarius Commission （CAC）

10?Bates S S， Hubbard K A， Lundholm N， Montresor M， Leaw C P. Harmful Algae， 2018， 79： 3-43

11?Sminth J， Connell P， Evans R H， Gellene A G， Howard M D A， Jones B H， Kaveggia S， Palmer L， Schnetzer A， Seegers B N， Seubert E L， Tatters A O， Caron D A. Harmful Algae， 2018， 79： 87-104

12?Louw D C， Doucette G J， Lundholm N. Harmful Algae， 2018， 75： 118-128

13?Delegrange A， Lefebvre A， Gohin F， Courcot L， Vincent D. Estuar. Coast. Shelf Sci.， 2018， 214： 194-206

14?Mccabe R M， Hickey B M， Kudela R M， Lefebvre K A， Adams N G， Bill B D， Gulland F M D， Thomson R E， Cochlan W P， Trainer V L. Geophys. Res. Lett.， 2016， 43： 10366-10376

15?Li Y， Huang C X， Xu G S， Lundholm N， Teng S T， Wu H Y， Tan Z J. Harmful Algae， 2017， 67： 119-130

16?JI Wei， ZHENG Jie-Ying， ZENG Xue-Ping， LAN Yu-Xue， LIU Ya， JI Hong-Wu. Mod. Food Sci. Technol.， 2011， 27（1）： 120-122

吉 薇， 鄭潔瑩， 曾雪萍， 藍玉雪， 劉亞， 吉宏武. ?現代食品科技， ?2011， 27（1）： 120-122

17?WANG Qian， CHENG Jin-Ping， GAO Li-Li， DONG Yu， WANG Wen-Hua. J. Anhui Agric. Sci.， 2011， 39（26）： 16070-16073

王 茜， 程金平， 高利利， 董 宇， 王文華. ?安徽農業科學， ?2011， 39（26）： 16070-16073

18?Lin Z， Wang D， Peng A， Huang Z. Int. J. Polym. Anal. Charact.， 2017， 22（3）： 202-209

19?Chen Q， Deng L， Chi J， Liu M， Lin X， Xie Z. RSC Adv.， 2017， 7（85）： 53778-53784

20?Gagez A L， Bonnet A， Pineau P， Graber M. Int. J. Environ. Anal. Chem.， 2017， 97（12）： 1-14

21?LIU Ren-Yan， XU Dao-Yan， DONG Yu-Hua， LIANG Yu-Bo. J. Hyg. Res.， 2009， 38（5）： 622-624

劉仁沿， 許道艷， 董玉華， 梁玉波. ?衛生研究， ?2009， 38（5）： 622-624

22?Dursun F， nlü S， Yurdun T B. Bull. Environ. Contam. Toxicol.， 2018， 100（3）： 457-462

23?Chan I O， Tsang V W， Chu K K， Leung S K， Lam M H， Lau T C. Anal. Chim. Acta， 2007， 583（1）： 111-117

24?Zhang W M， Lin M X， Tong P， Lu Q M， Zhang L. J. Chromatogr. A， 2016， 1443： 54-61

25?Wang Z， Maucher-Fuquay J， Fire S E， Mikulski C M， Haynes B， Doucette G J. Anal. Chim. Acta， 2012， 715： 71-79

26?Iglesia P D L， Giménez G， Diogène J. J. Chromatogr. A， 2008， 1215（1）： 116-124

27?LI Xiao-Ya， ZHANG Yong-Tao， GUI Jian-Ye， ZHANG Chen-Ling， ZHANG Jing， ZHANG Li. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（9）： 1375-1380

李曉亞， 張永濤， 桂建業， 張辰凌， 張 晶， 張 莉. ?分析化學， ?2017， 45（9）： 1375-1380

28?ZHOU Xiu-Jin， ZHOU Xiang-Yang， ZHENG Bin， SHAO Hong-Hong， WANG Shu-Na. J. Zhejiang Ocean Univ.， 2012， 31（3）： 211-214

周秀錦， 周向陽， 鄭 斌， 邵宏宏， 王淑娜. ?浙江海洋學院學報（自然科學版）， ?2012， 31（3）： 211-214

29?WANG Chan， ZHAO Yong-Tuo， PENG Xin-Ting， SUN Xing-Quan， LIU Hui-Ying， ZHANG Yu. J. Food Quality， 2015， （1）： 72-77

王 嬋， 趙永拓， 彭心婷， 孫興權， 劉慧穎， 張 彧. ?食品安全質量檢測學報， ?2015， （1）： 72-77

30?HONG Zhuan， ZHANG Yi-Ping， CHEN Wei-Zhu， GAO Ya-Hui. J. Anal. Sci.， 2014， 30（3）： 319-322

洪 專， 張怡評， 陳偉珠， 高亞輝. ?分析科學學報， ?2014， 30（3）： 319-322

31?Wang Z， King K L， Ramsdell J S， Doucette G J. J. Chromatogr. A， 2007， 1163： 169-176

32?Barbaro E， Zangrando R， Rossi S， Cairns W R， Piazza R， Corami F. Anal. Bioanal. Chem.， 2013， 405（28）： 9113-9123