linc00152通過調控DNMT3A和DNMT3B促進人宮頸癌細胞生長與侵襲

(廣東省第二人民醫院病理科，廣東 廣州 510317)

宮頸癌是女性最常見的癌癥類型之一，特別是在發展中國家。此外，宮頸癌也是導致女性癌癥死亡相關的第四大常見因素[1]。近年來宮頸癌的發病狀態呈年輕化趨勢，盡管早期癌癥患者可通過手術與放療等獲益，但仍有部分患者預后不良，大多死于轉移與復發。因此，闡明宮頸癌發生及轉移的分子機制對促進新型治療策略的發展至關重要。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸、有功能的非編碼RNA。多項研究報道lncRNA參與細胞多方面生物學狀態并且與腫瘤發展密切相關，但只有少部分lncRNA的功能特點和分子機制得到證實。其中，linc00152由828個核苷酸組成，位于2p11.2染色體。最初在肝癌中被發現具有差異低甲基化狀態，并且被證實其通過多種機制來調節基因表達，包括表觀遺傳修飾[2]和lncRNA-miRNA[3]和lncRNA-蛋白質相互作用[2]。多項研究已表明，linc00152在多種惡性腫瘤中，如胃癌[4]、膽囊癌[5]、腎透明細胞癌[6]表達上調并發揮癌基因樣作用。然而，linc00152在宮頸癌中的生物學功能及其機制尚不清楚。因此，linc00152在調控宮頸癌的發生、發展中的作用亟待研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞以及人正常宮頸上皮細胞株End1/E6E7細胞購于中國科學院細胞庫，RNeasy Mini Kit購于Qiagen公司，Reverse Transcription Kit與SYBR Green染料購于Biorad公司，RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司。

引物序列：linc00152：5′-TTGATGGCTTGAACATTTGG-3′and5′-TCGTGA TTTTCGGTGTCTGT-3′；β-actin:：5′-TCACCAACTGGGACGACATG-3′and5′-GT C ACCGGAGTCCATCACGAT-3′，均由Qiagen公司合成，sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B、si-control、Lipofectamine 2000、Transwell小室均購于美國Invitrogen公司，MTT購于美國Sigma公司，DNMT3A、DNMT3B和β-actin抗體以及二抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測linc00152的表達

培養SiHa、HeLa細胞以及End1/E6E7細胞，用RNA抽提試劑盒抽提三種細胞中的總RNA，再經逆轉錄試劑盒合成cDNA存于-70 ℃。qRT-PCR擴增反應體系包括2x QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10μL，10x miScript Universal Primer 2 μL，10x miScript Primer Assay2 μL，Template cDNA 1 μg，RNase-free water加至共20 μL。循環體系為：Cycle 1：37 ℃ 15 min，3個循環；Cycle 2：94 ℃ 5 sec，55℃ 5 sec，70 ℃ 5 sec，40個循環；Cycle 3：4 ℃ 5 sec，在CFX96實時熒光定量PCR系統上檢測。以β-actin為內參，所測定的linc00152的相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3 Western blot法檢測linc00152對DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的影響

培養HeLa細胞，將sh-linc00152和sh-control轉染質粒按轉染說明分別轉染于HeLa細胞中，細胞分為sh-linc00152和sh-control兩組，其中sh-control為對照組，轉染后細胞繼續培養48 h后收獲細胞。RIPA裂解細胞并提取兩組細胞總蛋白，用BCA法測定細胞的蛋白濃度，每組取等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉膜，封閉1h，加入DNMT3A、DNMT3B抗體或β-actin抗體，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1h，洗膜，ECL發光，X片曝光、顯影、定影，掃描圖片，并計算結果。

1.4 MTT實驗

培養HeLa細胞，將sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B以及si-control轉染質粒按轉染說明分別轉染于HeLa細胞中。細胞分為sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B以及si-control組，其中sh-control組為sh-linc00152組的對照組，si-control組為si-DNMT3A和si-DNMT3B組的對照組。分別取上述五組HeLa細胞接種于96孔板中，每組設5個復孔，培養至臨近飽和，每孔加滅菌MTT液(5 mg/ml)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO150 μL，低速振蕩10 min，選擇570nm波長在酶標儀上測定各孔吸光值，記錄結果，實驗重復3次。

1.5 Transwell侵襲實驗

細胞培養與分組同MTT實驗。在transwell小室中鋪加8μL稀釋好的基質膠，過夜形成基質膜。取100 μL即含1×105個細胞/ml的細胞稀釋液，接種于transwell小室上層，下腔加500 μL含20%FBS的培養液后，置于37 ℃溫箱中孵育36 h，取出，用棉簽擦棄小室上層未遷移的細胞，PBS液輕洗，4%多聚甲醛固定、結晶祡染色下層穿出細胞，PBS液洗，倒置，晾干。光學顯微鏡下觀察并攝相，隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值，實驗重復3次。

1.6 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，當P<0.05時，為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸癌細胞中linc00152表達水平

qRT-PCR檢測結果顯示，人宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞中linc00152的表達水平分別為(1.633±0.086，1.926±0.107)，與正常宮頸上皮細胞株End1/E6E7細胞的表達水平(0.426±0.068)比較，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測linc00152的表達與End1/E6E7細胞相比，**P<0.01。

2.2 轉染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B后HeLa細胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，轉染sh-linc00152組HeLa細胞中linc00152的表達水平明顯低于sh-control組(圖2)，差異具有統計學意義(P<0.01)；Western blot檢測結果顯示，轉染si-DNMT3A、si-DNMT3B組HeLa細胞中DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平明顯低于si-control組(圖3)，差異具有統計學意義(P<0.01)。結果提示sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B均轉染成功。

圖2 Hela細胞中sh-linc00152表達與sh-control組相比，**P<0.01；

圖3 Hela細胞中DNMT3A和DNMT3B蛋白表達

2.3 linc00152對DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的影響

研究顯示，DNMT3A和DNMT3B與宮頸癌的進展有關，且受非編碼RNA的凋控。為明確在宮頸癌細胞中linc00152對DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的影響，采用Western blot檢測。結果顯示，在HeLa細胞中，sh-linc00152組DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平明顯低于sh-control組(圖4)，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖4 DNMT3A和DNMT3B蛋白表達

2.4 linc00152對人宮頸癌細胞增殖的影響

MTT結果顯示，在HeLa細胞中，sh-linc00152組、si-DNMT3A以及si-DNMT3B組HeLa細胞的OD值分別為(0.413±0.061，0.409±0.0531，0.407±0.048)，與sh-control組，si-control組相比(0.750±0.063，0.743±0.080)，差異均具有統計學意義(P<0.05，圖5)。提示在HeLa細胞干擾linc00152、DNMT3A以及DNMT3B表達能抑制HeLa細胞的增殖。

圖5 MTT法檢測細胞增殖能力與sh-control組，si-control組相比，*P<0.05。

2.5 linc00152對人宮頸癌細胞侵襲的影響

Transwell結果顯示，在HeLa細胞中，sh-linc00152組和si-DNMT3A以及si-DNMT3B組HeLa細胞穿過基質膠的細胞數量分別為(65±5)、(71±4)、(73±5)，與sh-control組，si-control組(115±7)、(126±6)相比，差異均具有統計學意義(P<0.01，圖5)。提示在HeLa細胞干擾linc00152、DNMT3A以及DNMT3B表達能抑制HeLa細胞的侵襲。

3 討 論

近年來，lncRNA在腫瘤發生、發展中的生物學功能及其分子機制已經成為研究熱點。越來越多研究已經證實了lncRNA參與腫瘤的發生發展[7]，如肝癌[8]、胃癌[9]、尿路上皮癌[10-11]，并在惡性腫瘤中表達失調及功能異常。在體外研究中顯示[12]，linc00152在胃癌細胞系中的表達明顯高于正常胃粘膜上皮細胞，在胃癌細胞中敲低其表達可抑制細胞增殖和克隆形成，可促進G1期細胞周期停滯、觸發晚期凋亡，抑制上皮細胞-間充質轉化(EMT)與細胞的遷移與侵襲。研究表明[13]，在肝癌MHCC-97H細胞株中，linc00152的轉錄本主要存在細胞核中，且linc00152在體外可促進細胞增殖，在體內可促使腫瘤生長。此外，微陣列分析顯示，linc00152通過與上皮細胞粘附分子(EpCAM)啟動子結合可以激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑，從而調節腫瘤細胞的增殖、分裂以及腫瘤的發生。Cai等[5]證實，在膽囊癌中，linc00152明顯促進癌細胞增殖、轉移與抑制凋亡。Wu等[6]研究發現在腎癌細胞系中linc00152表達上調不僅能促進細胞增殖與侵襲，還能抑制G1期細胞周期阻滯并抑制細胞凋亡。本次研究通過采用qRT-PCR技術在宮頸癌細胞與正常宮頸細胞中檢測發現，linc00152在宮頸癌細胞中的表達明顯高于正常宮頸細胞，與上述研究相符。進一步通過MTT實驗、Transwell實驗研究發現，在宮頸癌細胞中敲低linc00152的表達能明顯抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲，表明linc00152在宮頸癌中發揮癌基因樣作用。

圖6 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力與sh-control組，或si-control組相比，**P<0.01。

DNA甲基轉移酶(DNMTs)是一類參與DNA甲基化的酶，通過影響DNA甲基化，在多種生命活動進程中發揮重要作用，如染色質結構的調控、X染色體的失活和基因組的穩定[14]。哺乳動物中DNA甲基轉移酶家族可分為：DNA甲基化維持酶(DNMT1)以及DNA從頭甲基化酶(DNMT3A和DNMT3B)。目前，隨著對表觀遺傳學的深入研究，DNA甲基化在轉錄沉默和抑癌基因功能丟失中發揮重要作用[15]。無論基因組DNA過甲基化或去甲基化均可能導致抑癌基因的突變或改變其轉錄過程，進而引起細胞表型的改變。近年來，DNA異常甲基化與惡性腫瘤之間的相關性也引起了眾多學者的關注，并獲得了一些進展。研究證實DNA甲基轉移酶(DNMT)在多種惡性腫瘤，如胃癌[16]、肝癌[17]、肺癌[18]中表達增加。DNMT3A和DNMT3B與宮頸癌的進展有關[19]。此外，非編碼RNA在哺乳動物中調控DNA甲基轉移酶的重要作用已被證實，同時已有相關調控機制的研究[20]。同樣地，在本研究中，我們觀察到在宮頸癌細胞中敲低linc00152可顯著抑制DNMT3A和DNMT3B表達。本研究還觀察到在宮頸癌細胞中敲低DNMT3A和DNMT3B后亦能抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，linc00152在宮頸癌細胞中表達增高且抑制linc00152的表達，能夠抑制宮頸癌細胞增殖與侵襲，其作用可能是通過調控DNMT3A和DNMT3B信號通路發揮的。這些結果為linc00152參與宮頸癌發生發展的可能分子機制提供了一個新的思路，linc0015也有望成為宮頸癌患者潛在的治療靶點。