干燥溫度及生長年限對黔產青錢柳中槲皮素和山柰素含量的影響

殷少文 葉世蕓 王維

摘要：采用高效液相色譜法，研究不同生長年限及炮制方式對黔產青錢柳中槲皮素和山柰素含量的影響，確定最佳的干燥溫度，考察種植年限對其品質的影響。通過正交試驗，確定樣品處理條件為用80%甲醇回流1 h，4 mL鹽酸水解1 h。采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為甲醇：0.4%磷酸（65 ∶ 35），進樣量10 μL，流速1 mL/min，在360 nm檢測波長下建立槲皮素和山柰素的含量測定方法，以槲皮素和山柰素含量的總和為指標，確定最佳的干燥溫度和生長年限。通過對樣品提取條件和色譜條件的優化，槲皮素和山柰素分別在 3.12～99.8 μg/mL（r=0.999 8），3.23～103.4 μg/mL（r=0.999 9）內呈良好的線性關系，并且該方法穩定，結果可靠。對樣品的測定結果進行系統聚類和方差分析，結果表明，青錢柳的最佳干燥溫度為70～80 ℃，生長年限在3～5年內，其成品性狀最佳。

關鍵詞：青錢柳;干燥溫度;生長年限;槲皮素;山柰素;高效液相色譜

中圖分類號： S718.43 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0189-05

青錢柳[Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinsk.]系胡桃科（Juglandaceae）青錢柳屬（Cyclocarya Iljinsk.），別稱搖錢樹或青錢李，是我國特有的單種屬高大速生喬木[1]，于冰川世紀保存至今，是國家重點保護的瀕危植物之一。據《中國中藥資源紀要》記載，其樹皮樹葉具有清熱解毒、祛癰止痛之功效，其根、莖、枝均可入藥[2]。青錢柳以茶飲為現代的主要應用方式。青錢柳茶是以青錢柳的初春嫩葉作為原料，經過簡單的炮制工藝制成的原葉茶形態的保健品。現代科學研究發現，青錢柳葉含多糖、三萜、酚酸、皂苷、黃酮等多種有效成分，同時還含有氨基酸、維生素、鍺、硒、鉻、釩、鋅、鈣等多種微量元素[3]，能夠增強人體免疫力，抗衰老抗氧化，特別適宜于現代三高類慢性疾病人群的飲用[4-7]。

青錢柳廣泛分布于我國貴州、云南、四川、湖南、湖北、福建等地。青錢柳是繼被人們譽為醫學界的第1棵樹——柳樹與第2棵樹——紅豆杉之后的醫學界第3棵樹，是大自然珍貴的寶藏[8]。在貴州省黔東南苗族侗族自治州地區，人們有長期飲用青錢柳茶的習慣，其茶飲氣清香、色澤鮮亮呈淺紅棕色、味甘如飴，具有生津止渴，清熱解暑功效，當地俗稱青錢柳為“甜茶樹”。研究發現，青錢柳中黃酮類化合物可清除人體內自由基，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、延緩衰老、增強心血管功能等作用[9]，還具有抗油脂氧化活性，能降低三高發病率[10-11]，因而備受人們關注。青錢柳中黃酮類化合物是青錢柳的有效物質基礎之一，本研究通過探討生長年限及干燥溫度對黔產青錢柳中黃酮類化合物含量研究的影響，為青錢柳產業化種植的采摘及加工提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜（Agilent型號：1260）;Agilent C18柱（規格：250 mm×4.6 mm，5 μm;型號：PN880975-902）;超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-100E）;鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司，型號：1122815404）;電子天平（瑞士梅特公司，型號：XS205）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（上海金穗生物科技有限公司，批號：20160322）;山柰素對照（上海金穗生物有限公司，批號：20160113）;色譜級甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20130410）;石油醚（重慶市川東化工有限公司，批號：20150901）;冰乙酸（天津光復科技發展有限公司，批號：20161006）;乙腈（天津科密歐化學試劑有限公司，批號：20151014）;試驗用純凈水。

所用青錢柳樣品采自黔東南苗族侗族自治州劍河縣雷山鎮八萬山林場的不同生長年限青錢柳，經貴陽中醫學院葉世蕓教授鑒定為胡桃科青錢柳屬青錢柳[C. paliurus （Batal） lljinskaja]。將不同生長年限新鮮青錢柳分別在陰干、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃條件下干燥。取干燥青錢柳用粉碎機粉碎，過60目篩備用。

1.3 對照品溶液的制備

精確稱取槲皮素對照品10.87 mg和山柰素對照品 10.60 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成混合對照品溶液。可根據試驗需求稀釋至各不同濃度。

1.4 供試品溶液的制備

取青錢柳粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL。密塞，稱定質量，加熱回流1 h，冷卻，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液 25 mL，精密加入鹽酸4 mL后置90 ℃水浴中加熱水解1 h，取出，迅速冷卻，轉移至50 mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜過濾，即得。

1.5 色譜條件

色譜條件為：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇：0.4%磷酸（65 ∶ 35），進樣量10 μL，流速 1 mL/min，檢測波長360 nm，理論塔板數按山柰素計算，不得低于4 000，2個成分與其他組分之間的分離度均大于1.50。

2 結果與分析

2.1 色譜條件和系統適應性試驗與結果

2.1.1 檢測波長的選擇 將供試品溶液和混合標準品溶液在“1.5”節的色譜條件下進行200～800 nm全波長掃描，以槲皮素和山柰素的峰面積為評價指標，結果表明，360 nm 為最佳掃描波長，結果見圖1和圖2。

2.1.2 流動相的選擇 將保留時間、理論塔板數、對稱因子作為流動相選擇的依據，通過查閱文獻，則可選擇流動相有：甲醇 ∶ 0.2%磷酸體積比為55 ∶ 50、60 ∶ 40、65 ∶ 35，甲醇 ∶ 0.4%磷酸體積比為55 ∶ 45、60 ∶ 40、65 ∶ 35、70 ∶ 30。在流動相優化過程中，調整甲醇和0.4%磷酸的體積比例，結果隨著甲醇體積分數的降低，槲皮素和山柰素的保留時間延長，并與雜質峰的分離度增大。當甲醇與0.4%磷酸的體積比為65 ∶ 35時，與雜質峰達到基線分離。為獲得好的分離效果和適宜的分離時間，最終確定流動相為甲醇 ∶ 0.4%磷酸（65 ∶ 35）。

2.2 樣品處理條件的優化

影響樣品含量測定的因素有甲醇濃度、回流時間、鹽酸用量及水解時間，根據單因素試驗結果，確定正交試驗水平（表1），結果見表2。

根據方差分析結果，樣品處理因素對試驗結果影響程度是甲醇濃度>回流時間>水解時間>鹽酸用量，并且甲醇濃度F=3.971，P=0.046<0.05，對結果有顯著性影響，其余因素的影響均不顯著。根據均值、極差和效應曲線（圖3），選擇最優的樣品處理條件：甲醇濃度為80%，回流時間為1 h，鹽酸用量4 mL，水解時間1 h。

2.3 標準曲線的測定

量取槲皮素和山柰素對照品母液，置于不同容量瓶，加甲醇定容至刻度，配置成不同濃度的混合標準品，各濃度見表3。按“1.5”節的色譜條件進行測定，結果見表3。以對照品溶液濃度為橫坐標（mg/mL），峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算出槲皮素回歸方程y=33 845x-0.967 7，山柰素回歸方程 y=37 834x+2.308 3，且槲皮素和山柰素分別在 3.12～99.8 μg/mL（r=0.999 8）、3.23～103.4 μg/mL（r=0.999 9）內具有良好的線性關系。

2.4 穩定性試驗

精確稱取樣品適量，按“1.4”節方法處理樣品，按“1.5”節的色譜條件進行含量測定，分別于0、1、2、3、5、6、7、8、9、10 h 連續進樣10次，測定其峰面積，結果見表4，槲皮素和山柰素的峰面積相對標準偏差分別是RSD=1.51%（n=10），RSD=0.81%（n=10）。結果表明，樣品在10 h內穩定性良好。

2.5 重復性試驗

稱取同一批藥材6份，每份約1.5 g，精確稱定，按“1.4”節方法處理樣品，按“1.5”節的色譜條件測定含量（表5），其槲皮素和山柰素平均含量值分別為0.156 4%和0.108 9%，RSD值分別為 1.53%、1.39%，結果表明該方法重復性良好。

2.6 精密度試驗

精確吸取10 μL槲皮素和山柰素濃度分別為 0.021 74、0.021 2 mg/mL的混合標準品，連續測定6次，結果見表6，其中槲皮素和山柰素峰面積的RSD值分別為0.17%和0.10%，表明儀器精密度良好。

2.7 加樣回收試驗

稱取同一樣品6份，分別精確加入2 mL 0.499 mg/mL 槲皮素和0.517 mg/mL山柰素，按供試品制備方法和色譜條件進行操作，進樣10 μL，結果見表7，通過加樣回收試驗，回收率均在95%～105%的范圍內，表明試驗過程可靠。

2.8 樣品的測定結果與分析

將備用的青錢柳樣品按“1.4”節方法處理后，按“1.5”節色譜條件進行測定，結果見表8。

隨機區組設計資料的方差分析結果（表9）表明，生長年限F=39.192，P=0.000<0.01，干燥溫度F=14.133，P=0.000<0.01，所以生長年限和干燥溫度對黔產青錢柳中黃酮類化合物的含量有顯著的影響。

基于不同干燥溫度下青錢柳中槲皮素和山柰素的總含量均值，采用系統分類的方法，對其干燥溫度進行分類，結果見圖4，當分為2類時，陰干、60 ℃、90 ℃、100 ℃為1類，70、80 ℃ 為1類。結合多重比較結果，低溫和高溫干燥對青錢柳的質量均有影響。以同樣的方式對生長年限進行聚類分析，其結果無規律可尋，通過均值分析，青錢柳在3年、4年、5年時黃酮類化合物的含量較其他生長年限高。

3 結論與討論

本研究通過單因素考察及正交試驗，優化了樣品處理的條件，通過對色譜條件的選擇，優選測定條件，以保證測定結果具有較好的穩定性和重現性。

通過對不同生長年限和不同干燥溫度的下的60份黔產青錢柳中槲皮素和山柰素的測定結果研究表明，生長年限和干燥溫度都會對樣品的質量產生顯著的影響。青錢柳的最佳干燥溫度為70～80 ℃，從本批樣品中可以得出，生長年限在3～5年的青錢柳質量較佳。在青錢柳炮制加工過程中也發現，同一時期采摘的青錢柳，生長年限越久，其葉片中木質化部分越高，在加工的過程中容易碎裂，影響成品性狀。

通過對貴州省劍河縣青錢柳種植基地的考察發現，其加工方式為傳統的茶葉炮制工藝，由于工藝簡單，效率低，造成很多青錢柳霉變，加工過程中葉片碎裂，造成資源的浪費，并且炒制的過程中無溫度控制，本研究的目的旨在解決青錢柳炮制過程中溫度的控制。研究發現，高溫干燥效率高，但當溫度超過80 ℃時，產品顏色加深，容易烤焦，而且影響其黃酮類化合物的含量。低溫干燥的效率太低，由于所需時間太長，造成青錢柳的霉變。對于生長年限而言，青錢柳屬于多年生植物，在本批采樣中，生長年限較長的葉片木質化程度較高，顏色較深，造成這種現象的原因可能是樹木過于高大，下面葉片沒有得到充分光照，具體因素還有待研究。

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