川芎嗪減輕博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化的作用機制研究

鄭小芳 胡慧佳 李躍 周燕 王利民

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明的以尋常性間質性肺炎為特征性病理改變的慢性間質性肺疾病，該病治療手段有限且療效欠佳，確診后中位生存期僅2～4年。近年研究發現吡非尼酮和尼達尼布等抗纖維化藥物在改善IPF患者癥狀及延緩肺功能下降方面有一定效果，但該類藥物價格昂貴且安全性尚未完全確認[1]。中醫學認為“瘀血內阻”貫穿該病始終，川芎為行氣活血的代表中藥，臨床及基礎研究證實以川芎為主的中藥制劑及其主要成分川芎嗪能改善百草枯、博萊霉素（bleomycin，BLM）、矽肺等因素所致的肺纖維化。其中BLM氣道內滴注所致的肺纖維化模型，其病理生理與人類肺間質纖維化相似，因此廣泛應用于IPF的研究。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認為是纖維化疾病發生、發展的重要機制之一，而Sonic Hedgehog（Shh）蛋白在肺損傷時過度激活，參與肺泡上皮細胞損傷后修復過程，最終引起肺組織重塑[2]。Coon等[3]研究表明Shh信號通路活性與組織纖維化程度呈正相關。本研究旨在探討川芎嗪減輕BLM誘導的大鼠肺纖維化的作用機制，以及該作用機制是否通過Shh信號通路抑制EMT過程來實現。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠60只，體重（230±20）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心屏障環境中，室溫（23±2）℃，相對濕度60%～70%，每日光照明、暗各12h，以標準飼料飼養，所有操作均通過浙江中醫藥大學實驗動物與倫理委員會批準。

1.2 主要材料及儀器 硫酸BLM（批號：H1608020，規格：20g，杭州瑞宏生物技術有限公司）；川芎嗪（批號：FY17630226，純度98%，南通經緯生物科技有限公司）；環巴胺（Cyc，批號：HBA20170706B，純度＞98%，南京特拉維斯生物科技有限公司）；羥脯氨酸測定試劑盒（批號：20171218，規格：50管/48樣，南京建成科技有限公司）；兔緊密連接蛋白-1（ZO-1）多克隆抗體（批號：057102，規格：100μl，美國 Proteintech 公司）；兔 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體（批號：81A40002015，規格：100μl，英國Abcam公司）；兔Shh多克隆抗體（批號：81A8420014，規格：100μl，杭州聯科生物技術股份有限公司）；兔膠質瘤相關癌基因同源物-1（Gli1）多克隆抗體（批號：GR3202163-7，規格：100μl，英國 Abcam公司）；病理圖文分析系統（德國卡爾蔡司公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及造模 采用隨機數字表法將60只SD大鼠分為對照組（Con組）、模型組（BLM組）、川芎嗪低劑量組（L-Lig組）、川芎嗪中劑量組（M-Lig組）、川芎嗪高劑量組（H-Lig組）和Shh通路抑制陽性對照Cyc組（Cyc組）6組，每組10只。除對照組外，其余5組采用一次性氣道滴注BLM溶液（藥物溶于0.9%氯化鈉溶液，4mg/ml）1.25ml/kg構建肺纖維化模型。于造模次日起，Con組和BLM組每日予0.9%氯化鈉溶液2.5ml/kg灌胃給藥，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組每日分別予川芎嗪溶液（藥物溶于0.9%氯化鈉溶液，8mg/ml）1.25、2.5和5.0ml/kg灌胃給藥，Cyc組每日予Cyc（藥物溶于10%DMSO溶液，2mg/ml）5.0ml/kg腹腔注射給藥，各組均給藥56d。實驗過程中Con組無動物脫組，BLM組脫組5只，L-Lig組、M-Lig組和 H-Lig組分別脫組 1、3、3 只，Cyc組脫組4只，最終Con組10只，BLM組5只，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組分別為9、7、7只，Cyc組6只。1.3.2 標本收集 造模后第56天處死大鼠并收集標本。1.3.2.1 血清 3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用剪刀先剪去劍突處鼠毛，75%乙醇溶液消毒皮膚，持5ml注射器針頭緊貼劍突下以30°斜行向上進針刺入心臟采血5～6ml，3 000r/min，離心10min后取血清保存至-20℃冰箱內。

1.3.2.2 肺組織 打開胸腔，分離肺組織（注意清理肺門周圍軟組織），切取左肺組織保存于-80℃冰箱，以備Western blot檢測；切取右肺組織在0.9%氯化鈉溶液中漂洗干凈，置于4%甲醛中固定，用于后續HE染色及Masson三色染色。

1.3.3 肺組織病理形態觀察及Ashcroft評分 右肺組織經甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋切片、脫蠟、HE染色、脫水封片后，光學顯微鏡100倍視野下觀察肺組織病理形態。根據Ashcroft評分標準[4]對肺泡炎和肺纖維化程度評分，0分：肺組織結構正常；1分：肺泡間隔或支氣管壁輕度增厚；3分：肺泡間隔或支氣管壁中度增厚，但不伴有明顯的肺泡結構紊亂；5分：肺泡結構破壞，有條索狀纖維帶或纖維組織團塊形成；7分：肺泡結構嚴重破壞，廣泛的纖維灶形成，蜂窩肺；8分：滿視野纖維化病灶；2、4、6分介于相應分數之間。

1.3.4 肺組織膠原沉積面積計算 右肺組織固定至切片，脫蠟步驟同上，經鐵蘇木素、麗春紅、苯胺藍染液完成Masson三色染色，使用病理圖文分析系統計算藍染的膠原沉積面積。

1.3.5 血清羥脯氨酸含量檢測 采用堿水解法。血清樣本經水解、調pH至6.0～6.8、加入活性炭后離心取上清液，檢測波長550nm處吸光度值，羥脯氨酸含量（μg/ml）=[（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度）] ×標準管含量（5mg/ml）×[（水解液總體積（10ml）/取樣量（ml）] 。

1.3.6 肺組織EMT相關指標ZO-1、α-SMA、Shh信號通路Shh蛋白及下游轉錄因子Gli1蛋白表達水平檢測采用Western blot法。取部分肺組織加入組織裂解液（每10mg肺組織加入200μl裂解液），于4℃勻漿機進行勻漿，14 000r/min，離心5min后取上清液，加5×上樣緩沖液后煮沸5min。制備10%SDS-PAGE膠，按40μg蛋白量上樣；80V電泳至Marker分離后改120V；300mA轉膜100min；5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入ZO-1（1∶2 000）、α-SMA（1∶1 000）、Shh（1∶1 000）、Gli1（1∶2 000）一抗后4℃過夜；TBST洗滌3遍后加入二抗，室溫搖床孵育2h；TBST洗膜后ECL顯像，以β-actin為內參，采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態及Ashcroft評分比較HE染色結果顯示Con組肺組織結構正常，肺內結構清晰，肺泡間隔正常，無明顯水腫、炎癥及纖維化表現，肺泡腔內無明顯滲出（圖1a，見插頁）；BLM組肺泡結構破壞明顯，肺泡腔萎縮或消失，部分肺泡出現斷裂、融合，形成肺大泡，肺泡間隔明顯增厚，肺間質被纖維細胞替代，肺間質纖維化形成，部分有炎性細胞浸潤（圖1b，見插頁）；L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和 Cyc組肺泡破壞，間隔增厚，炎癥細胞浸潤程度均較BLM組輕，肺間質被纖維細胞替代，呈不同程度肺間質纖維化，但程度較BLM組減輕（圖1c-f，見插頁）。肺組織Ashcroft評分結果顯示，與Con組比較，BLM組Ashcroft評分增加（P＜0.05）；川芎嗪或Cyc干預后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和Cyc組Ashcroft評分較均下降（均P＜0.05），但各組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 1。2.2 各組大鼠肺組織膠原沉積面積比較 Masson三色染色結果顯示Con組肺泡結構正常，被藍染區域極少（圖2a，見插頁）；BLM組肺泡結構明顯破壞，肺泡融合，肺間質、支氣管壁和肺泡隔被藍染區域面積明顯增加，間質膠原增生沉積呈彌漫性，呈片狀、束狀（圖2b，見插頁）；而L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和Cyc組肺泡結構破壞及藍染區域較BLM組明顯減少（圖2c-f，見插頁）。與Con組比較，BLM組膠原沉積面積增加（P＜0.05）；川芎嗪或Cyc干預后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和Cyc組膠原沉積面積均減少（均P＜0.05），但各組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 2。

表1 各組大鼠肺組織Ashcroft評分比較（分）

表2 各組大鼠肺組織膠原沉積面積比較（%）

2.3 各組大鼠血清羥脯氨酸含量比較 與Con組比較，BLM組血清羥脯氨酸含量增加（P＜0.05）；川芎嗪干預后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組血清羥脯氨酸含量均下降（均P＜0.05），但各組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；Cyc干預后，Cyc組與BLM組血清羥脯氨酸含量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

表3 各組大鼠血清羥脯氨酸含量比較（μg/ml）

2.4 各組大鼠肺組織ZO-1、α-SMA蛋白表達水平比較 與Con組比較，BLM組大鼠肺組織ZO-1蛋白表達水平下調（P＜0.05），α-SMA蛋白表達水平上調（P＜0.05）。川芎嗪或Cyc干預后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig和Cyc組大鼠肺組織ZO-1蛋白表達水平均上調（均P＜0.05），α-SMA蛋白表達水平均下調（均P＜0.05），見圖3和表4。

圖3 各組大鼠肺組織ZO-1、α-SMA蛋白表達的電泳圖

表4 各組大鼠肺組織ZO-1、α-SMA蛋白表達水平比較

2.5 各組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達水平比較 與Con組比較，BLM組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達水平均上調（均P＜0.05）；川芎嗪或Cyc干預后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和 Cyc組大鼠 Shh、Gli1蛋白表達水平均下調（均P＜0.05），見圖4和表5。

圖4 各組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達的電泳圖

表5 各組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達水平比較

3 討論

川芎嗪是中藥川芎的主要活性成分，大量研究證實川芎嗪可減輕BLM誘導的肺泡炎癥與肺間質纖維化[5-6]。本研究使用BLM誘導大鼠肺纖維化模型，探討川芎嗪的抗肺纖維化作用及其可能機制。

肺組織病理的改變是最直觀的療效衡量標準。本研究病理評分顯示，大鼠肺纖維化模型肺泡炎與肺纖維評分較Con組升高，表明本實驗模型制作成功。經川芎嗪干預后，大鼠肺組織Ashcroft評分下降，血清羥脯氨酸含量下降。由于羥脯氨酸是膠原的主要成分之一，其水平間接反映組織中膠原含量，提示川芎嗪能抑制BLM誘導的大鼠肺組織膠原沉積，降低肺組織羥脯氨酸含量及膠原沉積面積，減輕肺纖維化程度。

目前IPF的發病機制尚未完全明確，普遍認為與上皮損傷、炎癥、氧化應激等因素有關，使得肺組織損傷與修復失衡，肌成纖維細胞增多，細胞外基質堆積，肺組織重塑[7-8]。EMT被認為是多種疾病發生、發展的重要機制，包括發育障礙、器官纖維化、腫瘤等[9]。炎癥、氧化應激、內質網應激等可以激活EMT，導致上皮細胞標志分子如ZO-1表達下調，間質細胞標志分子如α-SMA等表達上調，上皮細胞失去極性，轉化成紡錘形的間質細胞，促進肺纖維化發生、發展[10-11]。本研究中，筆者檢測了EMT相關指標，結果顯示BLM組肺組織ZO-1蛋白表達水平下調，α-SMA蛋白表達水平上調，而川芎嗪干預后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組大鼠肺組織ZO-1蛋白表達水平均上調，且α-SMA蛋白表達水平均下調，提示川芎嗪通過抑制EMT，減輕肺纖維化程度。

另外有研究發現，IPF的發生與調控發育的信號通路的異常激活有關[12]，Shh信號通路正常活化是肺發育的必要條件，它控制了早期肺部發育和適當的肺分支形態形成時的EMT[13]。在其他器官中，Shh信號通路已被證實會促進纖維化。例如，在斑馬魚胰腺癌中，旁分泌的Shh信號會導致纖維化反應[14]、Shh通路過度激活也會促進腎纖維化[15-16]、肝纖維化[17]和硬皮病的皮膚纖維[18-19]。在成纖維細胞中激活Shh信號通路也可能是重要的發病機制，該基因信號會刺激成纖維細胞釋放膠原蛋白以及向肌纖維細胞分化[20]。研究證明，Shh信號通路參與基底增生、細胞外基質合成和α-SMA的表達過程[21-22]。已有研究通過瞄準Gli轉錄因子抑制Shh基因信號，在小鼠模型中預防肺纖維化取得理想結果[23]。本研究中，筆者檢測了Shh蛋白及其下游轉錄因子Gli1蛋白表達水平，并以Shh信號通路抑制劑Cyc為陽性對照。結果顯示，BLM組Shh、Gli1蛋白表達水平均高于Con組，川芎嗪能夠抑制Shh信號通路，減少Shh、Gli1的表達。同時結果顯示，Cyc能抑制BLM誘導的大鼠肺組織膠原沉積，并能抑制BLM誘導的ZO-1蛋白表達水平下調及α-SMA蛋白表達水平上調。提示Shh信號通路參與了BLM誘導的肺纖維化過程，同時抑制Shh信號通路是川芎嗪改善BLM誘導的大鼠肺纖維化的機制之一。

綜上所述，Shh信號通路參與了肺纖維化的形成，川芎嗪通過抑制Shh信號通路，從而抑制EMT，減輕BLM誘導的肺纖維化模型的肺泡炎癥及肺纖維化程度，為川芎嗪治療IPF提供了理論依據。