IL-34在巨噬細胞分化中的作用研究①

劉曉禮 王 昊 張東玥 王麗娜 鄭國光

(中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院血液學研究所 實驗血液學國家重點實驗室 國家血液病臨床醫學研究中心,天津300020)

IL-34是2008年發現的一種新型白細胞介素[1]，與巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF/CSF1)作用于同一受體CSF1R[2]。IL-34與M-CSF功能有顯著重疊，均可促進單核細胞、巨噬細胞以及破骨細胞的增殖、分化和生存[3,4]。然而二者表達具有時空差異[5,6]，且在基因序列和結構上缺少同源性[7,8]，導致功能亦存在差異。有研究報道，IL-34 和 M-CSF均可誘導免疫抑制型巨噬細胞的產生[9]，但兩種巨噬細胞在分泌細胞因子及M1/M2極化方面存在差異[10]。目前IL-34 和 M-CSF在病理和生理條件下的功能差異并未完全闡明。本文通過體外誘導小鼠骨髓細胞向巨噬細胞分化實驗，研究兩者在巨噬細胞分化過程中的作用差異。

1 材料與方法

1.1實驗材料 8～10周雌性C57BL/6J小鼠購自實驗血液學國家重點實驗室實驗動物中心。α-MEM培養基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，重組鼠源M-CSF和IL-34均購于PeproTech公司，TRIzol購自Thermo公司。流式抗體CD11b-PerCp-Cy5.5和Annexin-V/PI細胞凋亡試劑盒購于BD公司，F4/80-APC購于eBioscience公司。引物在華大基因科技股份有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1骨髓細胞培養 取小鼠股骨和脛骨髓腔內細胞，ACK裂解液裂解紅細胞后，按1.5×106個/孔均勻鋪于12孔板中，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基于37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養。在骨髓細胞向巨噬細胞分化實驗中，用不同濃度(50、100或150 ng/ml)IL-34和50 ng/ml M-CSF作用骨髓細胞3或6 d；在巨噬細胞表型維持實驗中，先用50 ng/ml M-CSF誘導骨髓細胞6 d后，再分別用50 ng/ml M-CSF、100 ng/ml IL-34、100 ng/ml LPS和無因子(對照組)條件下繼續培養3 d。分別在3、6和9 d取細胞用于實驗檢測。細胞每3 d換一次液，在第3天換液時，保留懸浮細胞；第6天換液時，棄懸浮細胞。

1.2.2細胞形態觀察 將培養3、6和9 d的細胞置倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄形態。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞表型 棄培養基和懸浮細胞，用刮刀刮取法收集貼壁細胞，PBS洗1次，用細胞計數板在顯微鏡下計數后，用1∶100的抗體稀釋液重懸細胞，避光冰浴30 min 后，用PBS洗去未結合的抗體并重懸，流式細胞儀檢測各組細胞表面分子表達水平，并設置未標抗體的陰性對照組，采用FlowJo10軟件分析實驗數據。實驗重復3次。

1.2.4RT-PCR法檢測巨噬細胞極化相關基因表達 收集貼壁細胞，用PBS清洗1次，TRIzol法提取總RNA,測定RNA濃度并逆轉錄為cDNA。以GAPDH作為內參對照，RT-PCR法測定M-CSF和IL-34誘導巨噬細胞極化相關基因mRNA的表達水平(引物序列詳見表1)。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，循環48次終止反應。采用2-ΔΔCt法計算極化相關基因mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡 收集貼壁細胞，用Annexin-V-結合緩沖液重懸后加抗體Annexin-V-FITC，室溫避光15 min，加入PI用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例，采用FlowJo10軟件分析實驗數據。

2 結果

2.1IL-34對巨噬細胞增殖的作用 用不同濃度(50、100或150 ng/ml) IL-34和50 ng/ml M-CSF作用于骨髓細胞，3 d后，各組均出現帶偽足的細胞，其形態無顯著差異(圖1A)。流式細胞儀分析發現，因子處理組CD11b+F4/80+巨噬細胞的比例和絕對數均顯著高于對照組(均P<0.001)，而100 ng/ml IL-34組與M-CSF組比較差異無顯著統計學意義；不同濃度IL-34組間比較發現，隨IL-34濃度增大巨噬細胞絕對數顯著增高(均P<0.01；圖1B、C)。作用6 d后，懸浮細胞大部分凋亡，呈長梭形貼壁細胞的比例增多，流式細胞儀分析發現變化趨勢與3 d時基本一致(圖1A、D、E)。

表1 RT-PCR引物序列

Tab.1 Sequence of RT-PCR primers

GeneForwardReverseGAPDH5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATT-3′5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′IL-12β5′-ATGTGGAATGGCGTCTCTGTCT-3′5′-TGGGCGGGTCTGGTTTGA-3′iNOS5′-CAGCGGAGTGACGGCAAAC-3′5′-AGACCAGAGGCAGCACATCAA-3′Arg15′-CAACCAGCTCTGGGAATCTG-3′5′-AATCGGCCTTTTCTTCCTTC-3′Mmp95′-TGAGTCCGGCAGACAATCCT-3′5′-CCCTGGATCTCAGCAATAGCA-3′IL-105′-CCAGAGCCACATGCTCCTA-3′5′-AGGGGAGAAATCGATGACAG-3′CXCL115′-AGCTGCTCAAGGCTTCCTTA-3′5′-AGTAACAATCACTTCAACTTTGTCG-3′IL-1β5′-TGCCACCTTTTGACAGTGAT-3′5′-TGTCCTCATCCTGGAAGGTC-3′TNF-α5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′CD2065′-CCTGAACAGCAACTTGACCA-3′5′-GCAATGGCCATAGAAAGGAA-3′CSF-15′-TCACAACCTCATCCTTCTGCG-3′5′-GACCCAGTTAGTGCCCAGTGA-3′

從以上結果可得出，IL-34與M-CSF均可促進巨噬細胞的增殖，IL-34的作用呈劑量依賴性，兩者誘導的巨噬細胞在形態上無顯著差異。

2.2IL-34對巨噬細胞分化相關標記表達的作用 因子作用3 d后，IL-34組巨噬細胞表面標記物CD11b和F4/80表達強度顯著低于M-CSF組，峰值左移(圖2A)；不同濃度的IL-34組MFI均顯著低于M-CSF組(均P<0.05)；而3個濃度的IL-34組之間CD11b的 MFI差異無顯著統計學意義(圖2B、C)。作用6 d后，結果同3 d時一致，IL-34組CD11b和F4/80表達強度也低于M-CSF組，并且峰值左移更顯著，MFI的變化與3 d時一致(圖2D、E、F)。從以上結果得出，IL-34與M-CSF誘導的巨噬細胞在分化表型上存在差異。

2.3IL-34對巨噬細胞極化相關基因表達的作用 為探究IL-34與M-CSF誘導巨噬細胞的極化狀態，利用RT-PCR方法分析M1型極化相關基因[IL-1β、誘導型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、C-X-C motif趨化因子11(C-X-C motif chemokine 11，CXCL11)、IL-12β和TNF-α]和M2型極化相關基因[細胞分化抗原206(Cluster of Differentiation 206，CD206)、IL-10、精氨酸1 (Arginase 1，Arg1)、CSF-1和基質金屬蛋白酶9 (Matrix metallopeptidase 9，Mmp9)]的表達情況。分析結果發現，IL-34誘導巨噬細胞的IL-1β、iNOS和IL-10表達高于M-CSF組(IL-1β,P<0.05;iNOS,P<0.05；IL-10,P<0.01)，而IL-12β表達低于M-CSF組(P<0.01；圖3A、B)。以上結果表明，IL-34與M-CSF誘導的巨噬細胞在M1型和M2型極化相關基因表達上存在差異。

2.4IL-34對M-CSF誘導巨噬細胞分化標記的作用 M-CSF誘導6 d的巨噬細胞，用IL-34作用3 d后，CD11b和F4/80的峰值顯著左移(圖4A)；且兩者的MFI均顯著低于M-CSF維持組(CD11b，P<0.05；F4/80，P<0.01)；相同的細胞用LPS刺激3 d后，CD11b和F4/80的MFI 均顯著高于M-CSF維持組(CD11b，P<0.05； F4/80，P<0.01；圖4B、C)。以上結果進一步表明IL-34作用后巨噬細胞的分化表型與M-CSF存在差異。

2.5IL-34對M-CSF誘導巨噬細胞增殖的作用 取M-CSF誘導6 d的巨噬細胞，分別在50 ng/ml M-CSF、 100 ng/ml IL-34、 100 ng/ml LPS或未加因子(對照組)條件下培養3 d。IL-34組與M-CSF組比較發現，IL-34可維持巨噬細胞的形態、比例和數量(圖5A～C)，并且凋亡情況比較差異無顯著統計學意義(圖5D)；而LPS刺激后，細胞形態發生改變，由偏M2型的長梭形變為偏M1型的煎蛋樣形狀(圖5A)，巨噬細胞比例差異雖無顯著統計學意義(圖5B)，但絕對數有降低趨勢(圖5C)，早期凋亡顯著增高(P<0.01，圖5D)。以上結果表明，IL-34可維持巨噬細胞的生存，進一步證明IL-34和 M-CSF在促進巨噬細胞增殖能力上差異無顯著統計學意義。

圖2 IL-34與M-CSF對巨噬細胞分化表型的作用Fig.2 Effects of IL-34 and M-CSF on differentiation phenotype of macrophageNote: A.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 3；B and C.MFI of CD11b (B) and F4/80 (C) on day 3；D.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 6；E and F.MFI of CD11b (E) and F4/80 (F) on day 6.*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

圖3 IL-34與M-CSF對巨噬細胞極化相關基因表達的作用Fig.3 Effects of IL-34 and M-CSF on expression of macrophage polarization related genesNote: A.The expression of M1 type polarization related genes in macrophages induced for 6 days；B.The expression of M2 type polarization related genes in macrophages induced for 6 days.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 IL-34對M-CSF誘導巨噬細胞分化的作用Fig.4 Effects of IL-34 on M-CSF induced differentiation of macrophagesNote: A.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 9；B and C.MFI of CD11b (B) and F4/80 (C) on day 9.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 IL-34對M-CSF誘導巨噬細胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Effects of IL-34 on M-CSF induced macrophage proliferation and apoptosisNote: A.Morphology of bone marrow derived cells on day 9；B and C.the proportion (B) and absolute number (C) of macrophages on day 9；D.the apoptosis was measured by Annexin-V/PI staining.*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

巨噬細胞是機體免疫系統重要成員，參與眾多生理、病理過程，其功能異常與多種疾病的發生、發展相關，因此探索巨噬細胞在不同疾病條件下的功能異常以及如何使用干預后的巨噬細胞進行疾病治療成為研究的熱點。穩定且易操作的體外獲取巨噬細胞的方法是相關研究的前提，M-CSF和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF)是體外由單核細胞誘導分化為巨噬細胞的常用因子，GM-CSF誘導分化的巨噬細胞具有更多M1型的性質，而M-CSF誘導分化的巨噬細胞具有更多M2型的性質[11]。體外誘導的巨噬細胞有多方面的用途，一方面用于體內、體外相關機制研究；另一方面經過進一步體外處理后回輸體內進行細胞治療，如在腎臟移植中，將供者的巨噬細胞輸注給受者，可提高移植器官的存活并發揮一定的免疫抑制作用[12]。最近有研究通過慢病毒感染在巨噬細胞導入嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)，獲得CAR-吞噬細胞，提高巨噬細胞的靶向吞噬能力[13]。IL-34誘導的巨噬細胞與M-CSF誘導的相似，偏向M2型性質，但有研究表明兩者誘導的巨噬細胞并不完全一致，功能和表型上的區別尚未闡明。本文旨在豐富巨噬細胞體外誘導體系，并為巨噬細胞應用提供有益的線索。

IL-34主要通過結合CSF1R發揮促進單核細胞增殖、分化和極化的作用[6,14]，目前研究顯示IL-34和M-CSF兩配體分別與CSF1R結合后，激活的下游信號通路并無顯著差異[10,14]。雖然兩者在支持巨噬細胞生長和存活上能力相當，但在誘導巨噬細胞分泌單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和嗜酸粒細胞趨化因子等細胞因子能力以及遷移能力上均存在差異[14]。除CSF1R外，IL-34還有另外兩個選擇性受體，受體型蛋白-酪氨酸磷酸酶ζ (Protein-tyrosine phosphatase zeta,PTP-ζ)和Syndecan-1(CD138)[15，16]，這也進一步暗示IL-34與M-CSF的功能可能并不完全重疊。盡管如此，目前仍未完全闡明IL-34與M-CSF功能上的差異。

之前研究發現，用IL-34和M-CSF誘導外周單核細胞，均可得到免疫抑制型巨噬細胞(IL-10highIL-12low)[17]。本研究利用IL-34與M-CSF刺激小鼠骨髓細胞，發現兩者在促進巨噬細胞增殖和存活上功能類似，均能誘導出呈長梭形的偏M2型的巨噬細胞。但進一步分析，發現IL-34誘導的巨噬細胞和M-CSF誘導的巨噬細胞仍存在差異。與M-CSF組對比，IL-34誘導巨噬細胞的分化標志物CD11b和F4/80的表達強度較弱，且隨著IL-34誘導濃度的增加有降低的趨勢；該現象在用IL-34培養M-CSF誘導的巨噬細胞時也同樣出現，IL-34作用后巨噬細胞CD11b和F4/80的表達強度弱于用M-CSF維持組。綜上，IL-34與M-CSF誘導的巨噬細胞在分化表型存在差異。

巨噬細胞本身具有很強的異質性和可塑性[18,19]，不同因子將其極化為不同狀態，故其功能也存在差異[20]。有研究表明，分別由IL-34與M-CSF誘導的巨噬細胞再經LPS + IFNγ 或IL-4刺激活化后，M1和M2的表型不完全相同，對T細胞和Treg細胞的活化也存在差異[10]。本研究發現，IL-34與M-CSF誘導的巨噬細胞M1型和M2型極化相關基因的表達也并不完全一致。與M-CSF組對比，IL-34誘導的巨噬細胞IL-1β、iNOS和IL-10的表達水平較高，而IL-12β的表達水平較低，這說明IL-34與M-CSF誘導巨噬細胞的極化狀態本身就存在差異。

IL-34的表達水平對機體的穩態有重要意義，異常表達與多種疾病相關[2]。目前的研究發現，IL-34表達升高一方面可激活機體免疫系統，與類風濕性關節炎等多種自身免疫病相關[3,21]；另一方面可募集M2性質的巨噬細胞，抑制免疫反應，與多種腫瘤的轉移和不良預后相關[3,22]。IL-34在機體中的功能具有爭議[3]，尚未研究透徹，仍需要不斷地探究。本課題通過研究IL-34與M-CSF對巨噬細胞分化的作用，證實IL-34與M-CSF雖然結合同一受體CSF1R,但功能仍存在一定差異,為采用IL-34或M-CSF誘導巨噬細胞進行基礎實驗和臨床應用提供理論基礎，也暗示了IL-34與M-CSF在生理和病理環境中調控的復雜性，為與IL-34、M-CSF相關的疾病治療提供思路。