自然光暴露對PRK法單眼遠視離焦幼年恒河猴角膜組織的影響

王 泳，劉良平，鐘興武，3

0引言

近視發病率近年全球性攀升，其發病呈低齡化和嚴重化趨勢[1]。盡管近視的發病機制至今未能明確，但大部分學者認為它是屈光發育期異常視覺經歷導致的屈光發育異常。流行病學研究證實增加戶外活動時間是防控青少年近視的獨立保護因素[2-5]，每周增加1h日光下戶外活動，近視發生風險下降2%。比較戶外與室內環境的視覺因素，自然光暴露是兩者區別之一。我們前期實驗結果表明每天自然光暴露3h可延緩幼年恒河猴遠視性光學離焦近視的發展，而且幼年期自然光暴露經歷也有利于維持雙眼的正視化[6]。因此自然光可作為保護因素在近視防控加以利用。然而，流行病學調查指出長期自然光暴露與翼狀胬肉、慢性結膜炎、復發性單純皰疹病毒性角膜炎等多種眼表疾病的發病率相關[7-8]。大量實驗研究也證實自然光中的多種光學成分及自然光的高輻射強度特性可破壞眼部組織正常生理狀態，造成光損傷[9-10]。為此，明確自然光對眼組織存在光損害，盡可能在防控近視和避免眼組織光損傷之間取得平衡，是制定合理近視防治措施的重要內容。本實驗比較不同光照條件下幼年恒河猴淚液多種細胞因子表達量，角膜組織形態學改變、細胞凋亡狀況及細胞氧化應激代謝產物含量，了解自然光是否在影響屈光系統發育的同時對眼表組織存在光損傷危險，為制定安全有效的近視防控手段提供更全面科學的實驗數據和理論依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物2月齡健康幼年恒河猴12只購于廣東藍島生物技術有限公司，雌性2只，雄性10只。依體質量和性別配對后，隨機分為兩組：人工照明組(artificial light group，AL組，n=6只)和自然光組(natural light group，NL組，n=6只)。本實驗獲中山大學中山眼科中心動物實驗倫理委員會審核批準(批準號：2014-069)。

1.1.2主要試劑QAH-CUST蛋白芯片試劑盒(RayBiotech)，蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所)、SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、MDA測試試劑盒(南京建成生物工程研究所),In Situ Cell Death TMR Tunel試劑盒(Roche),DAPI染劑(Sigma)，GTVisionTM Ⅲ通用型免疫組化試劑(DAKO)，TGF-β抗體(ab53169, Abcam),α-SMA抗體(ab18147,Abcam)。

1.2方法

1.2.1實驗設計12只幼猴均采用本課題組準分子激光角膜切削術(photorefractive keratectomy，PRK)制作單眼遠視離焦動物模型[11-12]，統一選擇右眼為手術眼(PRK眼)，矯正度數為-4.0D，切削直徑為5.0mm，左眼為對照眼。所有手術操作均由同一經驗豐富準分子激光醫師實施。單眼PRK術后10d開始動物分組處理，12h∶12h光照周期，照明時間為8∶00～20∶00，光源為熒光日光燈(YK28RR16,28W,6500K)。AL組幼猴始終室內飼養，NL組幼猴除雨天外，每天隨籠放置室外接受自然光照射4h(9∶00～11∶00和15∶00～17∶00)，照度計每天分別于9∶00、10∶00、11∶00、15∶00、16∶00和17∶00測量幼猴雙眼連線平面光照強度，范圍1320～24380Lx，其中60%以上監測時間點光照度高于10 000Lx。其余時間與AL組飼養于同一動物房，實驗時長共180d。

1.2.2幼猴haze分級比較于PRK術后3mo內每10d 1次，術后3～6mo內20～30d 1次裂隙燈顯微鏡檢查所有實驗幼猴術眼，按1990年Fantes分級標準[13]評估并記錄角膜haze情況，比較不同時間點兩組分級組成。

1.2.3淚液多因子蛋白質芯片檢測每組隨機選4只幼猴，于PRK術后50d戊巴比妥鈉靜脈全身麻醉下用毛細管虹吸收集雙眼淚液行多因子蛋白芯片檢測，每眼收集總量不少于10μL，標記離心后-80℃冰箱冷凍保存備用。按Ray Biotech公司QAH-CUST蛋白芯片試劑盒操作檢測淚液多種因子含量，包括：神經生長因子(nerve growth factor, NGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-23(interleukin-23，IL-23)、淋巴管內皮透明質酸受體-1(lymphatic vessel endothelial growth factor，LYVE-1)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1 )、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α )和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

1.2.4角膜病理組織及免疫組化檢查PRK術后180d，戊巴比妥鈉靜脈注射過量麻醉處死兩組幼猴，取1/2雙眼角膜組織、腎臟及眼外肌組織。4%多聚甲醛固定液固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡拍照對比組織結構。

1.2.5角膜免疫組織學檢查組織切片常規脫蠟，抗原修復，3%過氧化氫避光孵育。50μL一抗稀釋液(Anti-TGF-β1抗體1∶200；Anti-α-SMA抗體1∶80)于組織上，室溫孵育60min，PBS漂洗。50μL A液(GTVisionTMⅢ抗鼠兔通用型免疫組化檢測試劑盒內標記有辣根過氧化物酶和抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚體分子)于組織上，室溫孵育30min，PBS漂洗。滴加顯色劑DAB工作液50μL，室溫孵育，光鏡下控制顯色，蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染，常規脫水透明，中性樹脂封片。

1.2.6幼猴角膜TUNEL細胞凋亡檢測取組織石蠟切片，常規脫蠟、復水，PBS漂洗。組織切片浸入20μg/mL蛋白酶K Tris-HCl工作液中重組DNaseⅠ溶于50mmol/L pH7.5的Tris-HCl，25℃處理10min，制作陽性對照樣品。按說明書配制TUNEL反應混合液，每個組織樣本滴加50μL TUNEL反應混合液，37℃避光濕盒中反應60min，PBS漂洗。5mg/mL DAPI核酸染液，滴50μL于樣本，避光作用15min，PBS漂洗。50μL抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡檢測信號。

表1 兩組術后不同時間PRK眼haze分級比較例

組別20d≤0.5級≥1級30d≤0.5級≥1級40d≤0.5級≥1級50d≤0.5級≥1級60d≤0.5級≥1級AL組6060606060NL組6033152451 P10.1820.0150.0611

指標PRK眼(OD)AL組NL組tP對側眼(OS)AL組NL組tPNGF0.144±0.1710.158±0.21-0.1840.8610.169±0.193.40±5.66-0.9880.379EGF119.0±42.0955.93±26.712.5330.04584.62±23.1540.50±19.912.5020.067IFN59.45±57.31103.65±76.08-1.0020.35524.26±11.2247.55±22.62-1.5980.185IL-18.48±6.686.6±5.680.4200.6895.21±13.610.44±2.74-2.9670.061IL-1717.46±27.327.67±9.290.6780.5230.81±1.142.25±2.03-1.0120.369IL-696.01±8.1193.09±73.490.0790.940415.32±612.81167.28±102.380.6910.527IL-2379.40±58.15114.51±26.01-1.2590.25555.29±48.3135.05±31.720.6070.577LYVE-1200.71±123.06176.08±133.50.2710.795211.13±67.34168.83±44.840.9090.415TGF-β11106.47±146.211596.51±341.39-2.6420.038641.09±164.72716.39±196.63-0.5080.638TNF-a52.07±55.2646.02±34.590.1850.85919.12±18.0318.81±3.460.0300.978VEGF2264.88±903.851937.20±1155.80.4470.6713625.65±584.552308.59±787.962.3230.081

1.2.7幼猴角膜上皮組織丙二醛和超氧化物歧化酶測定室溫平衡保存于-80℃冰箱的角膜組織樣本，小圓刀片刮除角膜上皮組織，電子天平稱重，1∶9與4℃生理鹽水混合冰上機械勻漿，2500r/min離心10min，去上清液混合生理鹽水稀釋成0.5%角膜上皮組織勻漿。按蛋白定量測定說明書指引考馬斯亮藍法，波長595nm，測OD值，按公式計算待測定蛋白濃度。按丙二醛(MDA)測試盒(TBA法)說明書配制試劑，按操作步驟，波長532nm測OD值，按公式計算組織MDA含量。按超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法)說明書配制試劑，波長450nm測OD值，按公式計算SOD活力。

2結果

2.1幼猴PRK眼haze分級比較兩組幼猴PRK術后4d內術眼角膜上皮均完全愈合。實驗觀察期間，AL組幼猴術眼全程無明顯肉眼可見haze形成，即haze分級為0.5級及以下，50d僅2只幼猴haze為0.5級，其余角膜均透明；而NL組幼猴術后30～70d術眼發生不同程度haze，0.5級～2級不等，術后40～50d達高峰，此后逐漸減輕，70d后基本消退。兩組haze分級評估于40d差異具有統計學意義(P<0.05)，其余時間點無顯著性差異，見表1。

2.2淚液多因子蛋白質芯片檢測結果采用多因子蛋白質芯片檢測PRK術后50d兩組幼猴雙眼淚液11種細胞因子表達量，各細胞因子在幼猴淚液中有不同程度的表達，見表2。分析結果發現AL組與NL兩組間PRK眼淚液EGF和TGF-β1含量差異均具有統計學意義(P<0.05)，進一步比較組內雙眼淚液EGF含量無顯著性差異(AL組：t=1.819，P=0.166；NL組：t=1.428，P=0.249)，見圖1A。TGF-β1的組內雙眼淚液表達量則差異有統計學意義(AL組：t=8.757，P=0.003；NL組：t=3.620，P=0.036)，見圖1B。其余各細胞因子表達量組間和組內比較均無統計學差異，見表2。

2.3角膜免疫組織化學檢查光照實驗結束時(PRK術后180d)，兩組雙眼角膜全層組織TGF-β1和α-SMA免疫組織化學染色均為陰性，隨機取兩組幼猴腎臟組織為TGF-β1陽性對照，取兩組幼猴前臂肌肉組織為α-SMA陽性對照，排除角膜組織假陰性結果可能。結果表明術后180d，兩組PRK眼全層角膜組織無明顯TGF-β1(圖2)和α-SMA表達(圖3)，與對側眼一致。

2.4角膜病理組織學檢查實驗結束時AL組與NL組角膜病理組織學檢查結果基本一致，NL組PRK眼除前彈力層缺失外，其余各層組織與兩組對側眼結構一致。角膜上皮細胞完整，形態規則，排列整齊，細胞間連接緊密，細胞層數約5～6層；角膜基質層纖維排列規整，其中散在角膜細胞，未見炎癥細胞浸潤及典型成纖維細胞；角膜內皮細胞單層排列整齊，細胞間連接緊密(圖4)。

2.5角膜組織TUNEL檢測結果光照實驗結束時，兩組雙眼角膜全層組織偶見散在陽性染色細胞，兩組間無明顯差異，組間PRK眼與對側眼陽性染色亦無明顯差異(圖5)。經DNaseⅠ處理同組角膜組織切片為陽性對照，結果示角膜上皮細胞層、基質層及內皮細胞層可見明顯陽性染色(圖5D)，排除實驗結果假陰性可能。

2.6幼猴角膜上皮組織MDA和SOD活力測定兩組PRK眼和對側眼角膜上皮細胞SOD活力和MDA含量差異均無統計學意義(PRK眼：MDA：t=0.504，P=0.632；SOD：t=-0.429，P=0.683；對側眼：MDA：t=-1.161，P=0.297；SOD：t=-0.388，P=0.711)，見表3。

圖1兩組組內淚液EGF和TGF-β1比較A：組內EGF比較：AL組：t=1.819，P=0.166；NL組：t=1.428，P=0.249；B：組內TGF-β1比較：AL組：t=8.757，P=0.003；NL組：t=3.620，P=0.036；aP<0.05 PRK眼vs對側眼。

圖2幼猴角膜組織及腎臟組織TGF-β1免疫組織化學染色 (×400)A：AL組PRK眼角膜組織；B：AL組對側眼角膜組織；C：NL組PRK眼角膜組織；D：NL組對側眼角膜組織;E：陽性對照幼猴腎臟組織，箭頭所示為細胞漿內棕色陽性染色。

圖3幼猴角膜組織和肌肉組織α-SMA免疫組織化學染色(×400)A：AL組PRK眼角膜組織；B：AL組對照眼角膜組織；C：NL組PRK眼角膜組織；D：NL組對側眼角膜組織;E：陽性對照幼猴肌肉組織，箭頭所示為細胞漿內棕色陽性染色。

圖4兩組雙眼角膜病理組織學檢查，均為角膜全層切片(×200)A：NL組PRK眼；B：NL組對側眼；C：AL組對側眼。

圖5兩組雙眼角膜組織TUNEL染色(×200)A：AL組PRK眼；B：AL組對側眼；C：NL組PRK眼；D：NL組對側眼；E：陽性對照。箭頭所示為散在陽性染色。

指標PRK眼AL組NL組tP對側眼AL組NL組tPMDA含量(nmol/mgprot)3.45±0.523.24±0.660.5040.6322.97±0.613.38±0.38-1.1610.297SOD活力(U/mgprot)40.48±6.8242.60±7.17-0.4290.68340.16±5.2241.38±3.46-0.3880.711

3討論

大量研究已證實增加戶外活動時間是預防近視發生發展的保護因素，屈光發育期自然光暴露時間越長，近視風險越低[4, 14-15]。另一方面，過度自然光暴露可引起眼部組織的光損傷，其損傷程度取決于光源波長、光照強度、作用時間和組織生物學特性、代謝狀態。以紫外光為例，自然光中90%的紫外光被角膜上皮組織選擇性吸收，其光損傷的靶組織為角膜。鼠、兔和恒河猴的動物實驗已證實一定累積量的紫外線輻射可造成以細胞凋亡為主，伴炎癥細胞浸潤的組織病理學改變。進一步分子生物學發病機制研究表明，光化學損傷是角膜光損傷的主要原因，即足夠能量的光子破壞組織細胞的DNA、RNA或蛋白質結構，最終造成靶細胞凋亡[10, 16-17]。其中由光化學氧化應激產生的大量自由基、與凋亡相關的多種細胞因子失衡及信號通路改變被認為參與或介導了眼組織光損傷的細胞凋亡[18]。因此，在利用自然光防控近視的研究中，其安全性應引起足夠重視。

本研究自然光照射時間為每天4h，共170d，觀察自然光暴露對屈光發育期幼猴正常角膜組織的影響。實驗早期光照50d，AL組與NL組對照眼的淚液11種因子含量分析均無統計學差異，提示自然光照射未引起正常眼表多種炎癥、修復、免疫相關細胞因子改變。光照170d實驗結果顯示兩組角膜組織學結構未見明顯差異，TUNEL法檢測組織凋亡細胞數量兩組無明顯差異，提示本研究的自然光輻射量并未引起角膜特征性的光損傷組織病理學改變及凋亡細胞數量增多。檢測角膜上皮組織在氧化應激過程中重要的脂質過氧化產物MDA，以間接反映細胞氧化損傷的程度。兩組MDA含量差異無統計學意義，提示自然光并未增加角膜上皮細胞氧化損傷的程度。分析原因可能與以下兩個方面有關：(1)組織代謝狀態：正常眼部組織含有多種抗氧化物，如：抗壞血酸、維生素E、谷胱甘肽、過氧化氫酶、SOD、谷胱甘肽還原酶和過氧化酶等，可一定程度上抵御光化學氧化應激損傷。當抗氧化物抗氧化能力不足以清除氧化應激自由基產物時，組織即發生光損傷改變，而組織抗氧化能力隨年齡增加而降低[19]。本研究實驗對象為2～8月齡的幼年恒河猴，盡管未進行不同年齡組恒河猴角膜上皮組織抗氧化酶活性的比較，但根據其他文獻報道結果推測幼猴角膜上皮代謝功能旺盛，抗氧化物儲備充足，能及時清除自然光照射產生的細胞內脂質氧化產物，可能是本研究最終角膜組織維持正常形態結構的原因之一。(2)輻射能量：日常生活中戶外活動所接受的自然光輻射能量與所處緯度、海拔高度、季節、日時段、周圍環境、地面情況及是否有日照防護措施有關[20-21]。Zigman等研究結果顯示全年UVB最強輻射量出現在夏季中午11∶00～1∶00之間，北緯40度7月中午每小時UVB地面輻射量可高達1.1J/cm2[20]。但因為輻射量可被各種大氣成分和周圍環境植被和各種建筑物吸收和反射，而且在非直視太陽的情況下眼球組織有眼瞼保護，實際上僅17%～30%地面紫外輻射量可影響角膜組織，因此實際組織輻射量遠較地面輻射理論值低。本實驗觀察歷時170d，選擇上午9∶00～11∶00和下午15∶00～17∶00兩個時間段進行自然光照射，避開光照輻射最強時間段；而且猴籠及周圍綠色植被、建筑物也可一定程度降低輻射量，動態測量光照度發現僅個別時間點光照度高于20000Lx，遠低于夏日中午陽光直射60000～70000Lx的光照強度。研究表明，相同輻射量的照射光，照射時間越長，光損傷的可能性越小。Sliney等指出每天8h紫外線輻射總量為0.3mJ/cm2是角膜的安全輻射量，不會引起角膜組織光損傷性病理改變[22]。而Cejka等[23]使用波長312nm紫外線光源，每天照射2.5min，共4d可達紫外線輻射總量為0.25mJ/cm2，能引起兔眼角膜組織明顯水腫增厚，該輻射量相當于在紫外線輻射最強的夏日午間，人眼直視太陽2.56h角膜所接受的紫外線輻射總量。可見，角膜組織光損傷實驗研究中使用的照射光輻射能量遠高于人們日常生活進行的戶外活動中所接受的自然光輻射能量。本研究干預措施與現實情況更為接近，較低的輻射能量可能是角膜未出現光損傷改變的另一原因。

除正常角膜組織外，本研究通過幼猴PRK模型，觀察長期自然光暴露對角膜創傷愈合過程的影響。研究表明，PRK手術損傷后的角膜上皮細胞合成并分泌與炎癥反應、細胞增殖、細胞轉化和細胞外基質沉積等一系列修復相關的細胞因子，其中包括EGF、IL-1、IL-6、TGF、TNF-α、IFN-γ、NGF等。復雜的細胞因子網絡及其相互之間的級聯反應介導角膜上皮-基質相互作用，誘發并加重角膜基質細胞凋亡，激活傷口附近的角膜基質細胞增殖、移行，進而使其轉化為肌成纖維細胞，合成細胞外基質以完成修復反應[24-25]。細胞凋亡水平越高，后續角膜組織修復反應越劇烈，臨床表現為程度更為嚴重的角膜haze和屈光回退。因此動態評估術后角膜haze程度并檢測組織中的各種細胞因子含量和細胞凋亡數量可從不同角度反映角膜組織損傷修復的狀態。本研究AL組幼猴全過程無肉眼可見haze形成，組織修復反應輕，50d僅2只幼猴發生0.5級haze，與Zhong等[11-12]研究結果相符。而NL組在術后30～50d出現一過性haze形成，盡管未見3～4級嚴重haze發生，但術后40d的haze分級兩組間仍有顯著性差異，至術后70d NL組haze才基本消退，兩組haze程度和消退時間的差別提示本研究的自然光照射量可能加重了PRK術后修復反應并延長修復反應時間，其結論與Nagy等[26]研究相近。

進一步檢測術后50d淚液11種細胞因子含量，其中僅TGF-β1表達水平兩組組內PRK眼均較對側眼高，而且兩組PRK眼間也有顯著性差異，NL組高于AL組。TGF-β1是PRK術后角膜基質層修復最重要的細胞因子，在PRK術后的角膜上皮細胞、基質細胞、成纖維細胞中的表達增加，可誘導角膜細胞向肌成纖維細胞轉型，促使膠原合成，加速傷口愈合。組織修復程度越嚴重，TGF-β1水平越高，與haze分級正相關[27]。本研究NL組40～50d為haze形成高峰，TGF-β1淚液表達水平兩組間和組內雙眼間均有顯著性差異，提示PRK術后50d，角膜組織處于組織修復反應期，自然光照射通過增加TGF-β1表達水平加劇組織修復反應程度。如前所述，角膜組織吸收大部分自然光紫外線成分(波長295～400nm)，其中中波長紫外線UVB對角膜組織最具危害，高強度的UVB可引起角膜上皮急性損傷，如電光性眼炎；長波長紫外線UVA組織損傷閾值較高但可長期積累，有慢性光損傷的風險。研究表明，細胞凋亡是光損傷的主要病理改變，鑒于細胞凋亡與PRK術后組織修復反應的密切關系，我們推測自然光照射增加了角膜組織細胞凋亡的程度，引起修復相關細胞因子表達增加，從而加重了組織修復反應程度。此外，兩組PRK眼淚液EGF表達量差異有統計學意義，但兩組組內雙眼間表達量無顯著性差異。EGF是維持角膜上皮細胞穩定性的主要細胞因子，臨床上觀察PRK術后早期EGF表達量升高，術后1mo淚液EGF分泌量與術前無明顯差異[28]，原因可能是PRK術后組織損傷程度輕，不足以引起長期淚液EGF含量的明顯改變，與本研究兩組組內雙眼結果相符；而AL組PRK眼淚液EGF表達量高于NL組，有研究提示EGF與TGF-β在組織的表達量往往有相反的變化趨勢[29]，這一現象是否與細胞因子間的相互作用有關，還有待進一步研究驗證。而其他與炎癥和免疫相關的多種因子兩組間未見明顯差異，則提示PRK術后50d自然光照射并未加重角膜組織的炎癥反應。

在實驗結束時(PRK術后180d)，兩組PRK眼角膜組織結構病理學特征基本一致，組織內未見明顯纖維修復細胞因子TGF-β1及成纖維細胞標志物α-SMA陽性表達，兩組PRK眼凋亡細胞數量與對照眼均無明顯差異，均表明PRK術后180d角膜組織修復已完成，且自然光照射量并未引起不可逆的角膜組織結構改變。從另一角度說明本研究中的自然光紫外線輻射量雖能加重PRK術后角膜損傷修復活動期的反應程度，但對修復反應也已完成的角膜組織無明顯光損傷作用。

綜上所述，本研究所采用的自然光照射在延緩幼年恒河猴近視發生的同時，對正常的幼猴角膜組織無明顯光損傷作用。該自然光輻射量可加劇幼年恒河猴PRK術后修復早期的角膜組織修復反應，但遠期未對角膜組織造成不可逆損傷。