HMGB1在不明原因復發性流產患者外周血中表達水平及臨床意義

李杰蘭 潘秀婷

【摘要】 目的：探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在不明原因復發性流產（URSA）患者外周血中表達水平及臨床意義。方法：選取本院收治的52例URSA早孕婦女為觀察組，46例正常早孕婦女為對照組。比較兩組外周血輔助性T細胞17（Th17）、調節性T細胞（Treg）、Th17/Treg比值和相關指標（HMGB1、IL-17、IL-6、TGF-β及IL-10）的表達水平，分析HMGB1與各指標的相關性。結果：觀察組外周血Th17細胞和Th17/Treg比值均高于對照組，Treg細胞低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;觀察組外周血HMGB1、IL-17、IL-6水平均高于對照組，TGF-β、IL-10水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;相關性分析顯示，HMGB1與IL-6、IL-17、Treg、Th7均呈正相關（P<0.05），HMGB1與TGF-β、IL-10均呈負相關（P<0.05）。結論：URSA患者外周血HMGB1水平增高，其可能通過影響Th17/Treg平衡參與URSA的發病。

【關鍵詞】 高遷移率族蛋白B1; 不明原因復發性流產; Th17/Treg; 臨床意義

【Abstract】 Objective：To investigate the expression level and its clinical significance of HMGB1 in peripheral blood of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion（URSA）.Method：A total of 52 cases of early pregnant women with URSA were selected as observation group and 46 cases of normal early pregnant women as control group.The expression levels of helper T cell 17（Th17），regulatory T cell（Treg），Th17/Treg ratio and related indicators（HMGB1，IL-17，IL-6，TGF-β and IL-10）in peripheral blood of two groups were compared，and the correlation between HMGB1 and other indicators was analyzed.Result：The level of Th17 cells and Th17/Treg ratio in peripheral blood of observation group were higher than those of control group，the Treg cells was lower than that of control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The levels of HMGB1，IL-17 and IL-6 in peripheral blood of observation group were higher than those of control group，the levels of TGF-β and IL-10 were lower than those of control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The correlation analysis showed that HMGB1 was positively correlated with IL-6，IL-17，Th7 and Treg cells（P<0.05），while HMGB1 was negatively correlated with TGF-β and IL-10（P<0.05）.Conclusion：The increase of HMGB1 level in peripheral blood of URSA patients may be involved in the pathogenesis of URSA by affecting Th17/Treg balance.

【Key words】 High mobility group protein B1; Unexplained recurrent spontaneous abortion; Th17/Treg; Clinical significance

First-authors address：The Fourth Peoples Hospital of Nanhai，Foshan 528211，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.020

復發性流產（RSA）是指連續2次或更多次的自然流產，其發生病因很復雜，除了生殖道解剖異常的原因，染色體異常、內分泌異常和自身免疫疾病外，還未發現其他導致流產的原因，稱為同種免異型，也可稱為原因不明復發性流產（URSA）[1-2]。相關證據表明，不明原因的復發性流產可能與免疫因素有關，而母體胎兒免疫耐受是一種重要的免疫因子，占50%～70%[3]。國內外許多研究發現，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種強有力的促炎因子和炎癥介質，HMGB1通過與細胞表面受體結合的一系列信號轉導途徑促進炎癥反應的發展[4-6]。因此，本文旨在探討URSA是否參與到HMGB1的發生，通過分析HMGB1在URSA患者外周血中的表達水平，以為URSA的臨床診斷和治療效果提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月-2016年7月本院收治的52例URSA早孕婦女為觀察組。診斷標準：患者連續2次或更多次自然流產，無死產、活產史;檢查后沒有與流產有關的常見發現原因[7]。納入標準：既往無自然流產史;月經周期規律;年齡25～45歲。排除標準：甲狀腺功能異常、妊娠者;自身免疫性疾病者;低纖維蛋白血癥及血小板增多癥。另選取同期46例正常早孕婦女為對照組，均無遺傳和自然流產史，無死胎或解剖和內分泌異常，懷孕期間未發生生殖道感染。該研究由醫院倫理委員會審查，患者均被告知并簽署治療同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 儀器：CO2培養箱，Accuri C6型流式細胞儀（美國BD公司），離心機。試劑：鼠抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC、CD69-PE、IL-17和Foxp3-PE熒光抗體，PBMC細胞懸液、佛波醇、離子霉素、流式輔助試劑、RPMI-1640細胞培養基和同型對照試劑，破膜劑緩沖液。

1.2.2 流式細胞術檢查 （1）標本采集：抽取兩組次日清晨空腹靜脈血4 mL，然后在離心機中離心5 min，制備PBMC細胞懸液，最后貯存在冰箱中-20 ℃檢查。（2）采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測血漿HMGB1表達水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購于BD公司;（3）輔助性T細胞17（Th17）檢查：通過流式細胞術，在潔凈實驗臺上消毒30 min，向離子霉素、佛波醇、助流劑和RPMI-1640細胞培養基中加入150 μL靜脈血，將體積分數孵育6 h。5% CO2培養箱取出細胞懸浮液，轉移到試管中，離心加入RPMI-1640細胞培養基和同種型對照試劑搖動，在黑暗中培養30 min，加入透化緩沖液，除去上清液。然后用2 mL工作溶液離心。加入400 μL染色溶液，并使用Accuri C6流式細胞儀檢查Th17水平。（4）調節性T細胞（Treg）檢測：取100 μL PBMC細胞懸液于試管中，加入CD4-FITC、CD25-APC振蕩，在黑暗中孵育20 min，用緩沖液洗滌，取出上清液，檢查機器。然后加入Foxp3-PE熒光抗體和同種型對照試劑，在4 ℃孵育40 min，加入2 mL透化緩沖液，用工作溶液洗滌兩次，將細胞重懸于細胞染色緩沖液中，用流式細胞儀檢查。

1.3 觀察指標 比較兩組外周血中Th17、Treg細胞和Th17/Treg比例;比較兩組外周血中相關指標表達（HMGB1、IL-17、IL-6、TGF-β、Th7及IL-10）;分析HMGB1與IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10、Treg、Th7細胞因子的相關性。

1.4 統計學處理 使用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;相關性采用Pearson直線相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 兩組一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 兩組外周血中Th17、Treg細胞和Th17/Treg比例比較 觀察組外周血Th17細胞和Th17/Treg比值均高于對照組，Treg細胞低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 兩組外周血中相關指標表達比較 觀察組外周血HMGB1、IL-17、IL-6水平均高于對照組，TGF-β、IL-10水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 HMGB1與IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10、Treg、Th17的相關性分析 相關性結果顯示：HMGB1與IL-6、IL-17、Treg、Th17均呈正相關（P<0.05），HMGB1與TGF-β、IL-10均呈負相關（P<0.05），見表4。

3 討論

據報道，由于近一半的RSA患者原因尚不清楚，治療效果不理想，使其成為臨床上難治性不孕的原因[8]。因此，如何做好URSA患者外周血中表達及臨床意義已成為生殖醫學領域亟待解決的問題[9-11]。近年來，隨著生殖免疫學、遺傳學、分子生物學的迅速發展，URSA的基礎研究和臨床診斷得到了很大的改善[12]。眾所周知，URSA是非常有害的，因此探討其病因是生殖領域一項重要研究。

HMGB1是一種核蛋白，以其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移力而得名。于1999年首次發現，釋放到細胞外介導的炎癥反應中，作為局部和全身炎癥性疾病中的重要炎癥細胞因子[13-15]。可能是治療各種疾病的新靶點，還可能影響機體細胞免疫功能，引發感染后免疫功能紊亂。HMGB1在細胞核中的主要功能是與DNA結合。通過與各種轉錄因子，復制蛋白和類固醇受體相互作用，為了參與DNA復制、重組、修復和轉錄，細胞外HMGB1表達水平與免疫炎癥密切相關。這表明HMGB1的這種性質在其炎癥中起重要作用[16-17]。

本研究結果顯示，觀察組外周血Th17細胞和Th17/Treg均高于對照組，Treg細胞低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示URSA患者Th17和T細胞的表達明顯改變，但觀察組Th17/Treg高于對照組，對維持母體與胎兒間免疫耐受和良好的妊娠結局具有重要意義。以往研究表明Th17細胞是新發現的CD4+效應T細胞亞群，Treg細胞主要來源于胸腺。兩者之間的平衡對于維持正常和穩定的免疫狀態是必要的[18-20]。本研究結果顯示，觀察組外周血HMGB1、IL-17、IL-6水平均高于對照組，TGF-β、IL-10水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;其中HMGB1與IL-6、IL-17、Treg、Th7均呈正相關（P<0.05），提示HMGB1可促進炎癥因子的釋放;HMGB1與TGF-β、IL-10均呈負相關（P<0.05），提示HMGB1可通過作用于TGF-β和IL-10細胞調節免疫抑制性。上述這些結果提示，HMGB1的直接或間接調節可能是由于Th17和Treg細胞免疫功能障礙的作用，從而影響URSA患者的Th17/Treg平衡。

綜上所述，URSA患者外周血HMGB1水平增高，其可能通過影響Th17/Treg平衡參與URSA的發病。

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（收稿日期：2018-08-15） （本文編輯：董悅）