葫蘆素B靶向抑制STAT3抗吉非替尼耐藥非小細胞肺癌的研究

丘韶校 曾超朋 何臣 李元廣 宋衛東

[摘要] 目的 探討葫蘆素B通過抑制STAT3信號活化，從而拮抗EGFR T790M突變介導的NSCLC吉非替尼耐藥的機制。 方法 利用不同濃度的葫蘆素B作用于PC-9/GR細胞的不同時期，用CCK-8法測定細胞的增殖抑制、PI染色法檢測細胞的周期、Annexin-v/7-AAD雙標記法檢測細胞的凋亡，檢測不同濃度以及作用時間的葫蘆素B對PC-9/GR細胞增殖抑制、細胞周期阻滯及細胞凋亡誘導效應。 結果 葫蘆素B能夠顯著抑制PC-9/GR細胞增殖以及對細胞周期的G2/M期有明顯阻滯作用，而且呈濃度依賴，隨著濃度增加，其增殖抑制作用和阻滯活性也增高，同時觀察到PC-9/GR細胞分別加入10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L三種濃度的葫蘆素B作用后，抑制了p-Jak2、p-STAT3的表達，且這種抑制呈濃度依賴性，但不影響p-EGFR的激活以及總EGFR、Jak2、STAT3的表達。 結論 葫蘆素B能夠抑制吉非替尼耐藥NSCLC中異常激活的STAT3信號途徑，這種抑制具有選擇性，從而誘導吉非替尼耐藥NSCLC的凋亡。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌;吉非替尼;耐藥性;葫蘆素B

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）16-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of cucurbitacin B inhibiting STAT3 signaling to antagonize EGFR T790M mutation-mediated gefitinib resistance to NSCLC. Methods Different concentrations of cucurbitacin B were applied to different periods of PC-9/GR cells. Cell proliferation inhibition was measured by CCK-8 method， cell cycle was detected by PI staining， and cell apoptosis was detected by Annexin-v/7-AAD double labeling method. The effects of cucurbitacin B on the proliferation inhibition， cell cycle blockage and cell apoptosis induction of PC-9/GR cells were detected at different concentrations and effecting times. Results Cucurbitacin B could significantly inhibit the proliferation of PC-9/GR cells and significantly blocked the G2/M phase of the cell cycle， and was concentration dependent. As the concentration increased， its effects of proliferation inhibition and blockage also increased. At the same time， PC-9/GR cells were observed to inhibit the expression of p-Jak2 and p-STAT3 by adding cucurbitacin B at 10 nmol/L， 100 nmol/L and 1000 nmol/L， respectively. Moreover， this inhibition was concentration-dependent， but did not affect the activation of p-EGFR and the expression of total EGFR， Jak2， and STAT3. Conclusion Cucurbitacin B can inhibit the abnormally activated STAT3 signaling pathway in gefitinib-resistant NSCLC. This inhibition is selective， thereby inducing the apoptosis of gefitinib-resistant NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Gefitinib; Drug resistance; Cucurbitacin B

肺癌的早期診斷困難，70%的肺癌患者發現時已屬中晚期，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占其中絕大多數，比例達80%以上，但由于NSCLC對放化療不敏感，NSCLC的治療仍然是目前臨床面臨的難題，雖然有手術、化放療及中成藥等綜合治療，NSCLC的治療仍存在許多問題，5年生存率仍少于10%[1]。目前，靶向藥物已被廣泛應用于各種腫瘤患者的治療，療效顯著，吉非替尼作為NSCLC的靶向藥物，目前應用廣泛，是針對表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的靶向藥物，主要用于治療晚期NSCLC患者，對帶有EGFR 激活突變的NSCLC患者有顯著的治療效果，且副作用少，相對于傳統化放療具有明顯的優勢[2]。但目前國內外研究發現，絕大多數初期對吉非替尼治療有效的NSCLC患者，在經過10個月左右的緩解期后，出現病灶進展，出現獲得性耐藥[3]，因此，明確吉非替尼耐藥性產生的機制以及研究新方法對抗吉非替尼耐藥已經成為NSCLC治療領域中的熱門。

關于NSCLC治療中吉非替尼如何產生獲得性耐藥，其分子機制目前仍存在爭議，尚未完全明確，目前普遍的觀點認為，是由于基因的二次突變和原癌基因的擴增引起，其分子機制是EGFR基因外顯子20的T790M二次突變（約50%）和原癌基因c-MET的擴增，導致正常情況下EGFR酪氨酸激酶結合區ATP結合外，還阻止吉非替尼和酪氨酸激酶的進一步結合，導致EGFR蛋白激酶的持續激活，重新激活先前阻斷的磷酸化信號途徑，并促進腫瘤細胞的持續生長，從而產生耐藥[4-7]。但是，不管是基因二次突變，還是原癌基因擴增介導的獲得性耐藥，維持腫瘤的存活均需要EGFR及其下游MAPK/ERK或PI3K/AKT信號分子的持續活化，因此，近年來國內外許多學者針對以上耐藥機制進行了有益的治療探索。本研究旨在闡明利用葫蘆素B的信號分子導向作用，葫蘆素B能夠選擇性抑制吉非替尼耐藥NSCLC中持續活化的轉錄信號轉導子與激活子3（STAT3）信號途徑，從而誘導吉非替尼耐藥NSCLC細胞的凋亡，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司），葫蘆素B（美國Sigma公司），細胞培養瓶和培養板（美國Corning公司），抗人總EGFR抗體、磷酸化抗人EGFR抗體、抗人總Stat3抗體、磷酸化抗人Stat3抗體、預染SDS-PAGE低分子量Marker、發光Marker、山羊抗兔二抗、HRP標記的山羊抗鼠二抗（美國Cell Signaling公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司），牛血清白蛋白（BSA）（杭州天象人公司）。

1.2檢測方法[8]

1.2.1 細胞增殖抑制采用CCK-8法檢測? 對數生長期PC-9/GR細胞，胰酶消化，離心，取96孔培養板，每孔加入100 μL細胞懸液，置37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱靜置培養24 h，分別加入不同濃度的葫蘆素B（終濃度為10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L）的新鮮培養基，每一濃度重復3孔，設試劑對照組及細胞對照組，置37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱靜置培養;72 h后每孔加CCK-8溶液20 μL，繼續培養2 h，酶標儀上450 nm處測OD值，按下述公式：存活率=（A實驗組-試劑對照組）/（A細胞對照組-試制對照組）×100%，計算每一濃度的存活率。

1.2.2 細胞周期檢測采用PI染色法檢測? 對數生長期PC-9/GR細胞，0.25%胰蛋白酶消化、離心，按5×105/mL細胞濃度制成細胞懸液。取細胞懸液接種至6孔培養板，每孔12 mL細胞懸液，置于37℃、5%CO2培養箱內培養;培養24 h，更換新鮮培養基，加入不同濃度的葫蘆素B至終濃度分別為10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L及DMSO對照，置于37℃、5%CO2培養箱內分別繼續培養24 h、48 h;經離心、調整，最后避光染色30 min后流式細胞儀上機檢測，Multicycle軟件進行DNA分析。

1.2.3 磷酸化和總EGFR、B-Actin、Stat3及Jak2的表達采用Westen-blot（免疫印跡法）檢測? 對數生長期PC-9/GR細胞，0.25%胰蛋白酶消化、離心，按5×105/mL細胞濃度制成細胞懸液，取10 mL細胞懸液接種至10 cm培養皿中。待細胞生長至80%匯合時，換用含10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L葫蘆素B及DMSO對照的完全培養基培養，繼續培養6 h，分別提取總蛋白進行免疫印跡檢測磷酸化及總EGFR、Jak2、Stat3、B-Actin的表達。

1.3 統計學方法

所有實驗結果采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗及方差分析，并使用SPSS13.0軟件進行統計學的進一步分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各種濃度葫蘆素B對PC-9/GR細胞作用不同時間后檢測細胞增殖抑制率和G2/M期阻滯率

葫蘆素B能夠對PC-9/GR細胞增殖和G2/M期細胞周期阻滯起明顯抑制作用，且這種抑制作用呈濃度依賴性，隨著濃度的增加，其對細胞周期阻滯活性、細胞增殖抑制也出現相應增強，各組間對比，差異具有統計學意義（P<0.05）;當葫蘆素B濃度高于100 nmol/L時，葫蘆素B對PC-9/GR細胞的增殖抑制和細胞周期阻滯活性具有時間依賴性。隨著時間的延長，其抑制以及阻滯活性明顯加強，各組之間差異具有統計學意義（P<0.05）;其中用1000 nmol/L濃度的葫蘆素B處理48 h后，觀察到葫蘆素B對PC-9/GR細胞的增殖和細胞周期阻滯活性的抑制作用最強。細胞增殖抑制和細胞周期阻滯分別為（65.56±3.98）%和（57.34±3.92）%。見表1、2。

2.2 PC-9/GR細胞分別經三種濃度的葫蘆素B作用及作用6 h后分析

采用Western blot法檢測葫蘆素B不同濃度對PC-9/GR細胞EGFR、Jak2/STAT3信號轉導分子表達的影響，PC-9/GR細胞分別經三種濃度的葫蘆素B（分別為10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L）作用后，隨著葫蘆素B濃度的增加，其抑制p-Jak2、p-STAT3的表達作用越強，但對p-EGFR激活以及總EGFR、Jak2、STAT3的表達影響不明顯（圖1）。

PC-9/GR細胞分別經三種濃度葫蘆素B（分別為10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L）作用6 h后，檢測EGFR、Jak2/STAT3（Westen-blot法）信號轉導分子激活的程度，觀察到P-Jak2、p-STAT3表達是無活性的，并且具有濃度依賴性，而p-EGFR是持續的。

3 討論

葫蘆素B（cucurbitacin B）是從葫蘆科等植物中取得的，經過提取分離，已被證實具有多種藥理活性。上世紀，我國已經研發出葫蘆素B含量為60%的葫蘆素B/E單體復合制劑，其廣泛用于肝炎以及原發性肝癌的治療，其抗癌作用及其機制是近年研究的熱點[9-10]。近幾年國內許多外學者對葫蘆素B 的抗各種腫瘤的作用進行了較全面的研究，發現其抗腫瘤作用是因為其對STAT3 轉錄因子的活化有較強的抑制作用，且與抑制STAT3 轉錄因子的持續活化有關[11-13]。Zhang M等[14]研究表明，葫蘆素B能夠抑制A549肺癌細胞中STAT3轉錄因子的活化，而且這種抑制作用呈濃度依賴性，從而誘導A549細胞凋亡。

STAT3作為癌基因，在各種類型的細胞及組織中有廣泛表達，其在腫瘤細胞的增殖、生長、凋亡及腫瘤免疫微環境異常等的調節中發揮關鍵的作用，其在惡性腫瘤細胞中持續活化。目前發現，由于STAT3的活化水平在EGFR 突變的NSCLC 細胞中異常增高，因此，在EGFR 體細胞突變的NSCLC中，STAT3 的活化被認為是癌癥發生的必要條件[15]。Choi S等[16]研究發現，在多種人體實體瘤中，由于STAT3 的持續激活，細胞凋亡抑制因子（包括Bcl-2、Bcl-xl、MCL-1）和細胞周期調控因子（包括C-myc、CyclinD1 等）的表達出現上調，從而刺激腫瘤細胞的增殖、阻礙凋亡，并導致腫瘤細胞對化療藥物的耐藥。國內外的研究發現[17-19]，通過動物實驗抑制STAT3 的活化，惡性黑素瘤、胃癌及卵巢癌等對化療藥物的敏感性明顯提高。此外，有研究發現[20-21]，在各種耐藥癌細胞中檢測到STAT3 mRNA 水平在對化療藥物較敏感細胞中明顯增高。Cao W等[22]研究證實，高三尖杉酯堿能夠抑制IL-6/STAT3信號路徑，STAT3的活化受到抑制，利用高三尖杉酯堿能夠抑制吉非替尼耐藥NCI-H1975細胞增殖和誘導其凋亡。Gao SP等[23]研究發現，在STAT3的激活啟動時期發揮著關鍵的作用可能是EGFR的活化突變，而EGFR活化突變的NSCLC STAT3持續活化的主要調節因素是IL-6/STAT3/IL6自分泌/旁分泌環。但是，目前關于NSCLC中STAT3水平與吉非替尼耐藥關聯性的分子機制，我們的認識并不充分。

本研究顯示，葫蘆素B體外實驗能夠抑制PC-9/GR細胞的增殖并阻滯細胞周期G2/M期，這種作用呈濃度及時間依賴性，其機制與信號轉導通路受抑制密切相關，其分子機制是由于EGFR活化突變非依賴性的Jak2/STAT3信號轉導通路受到抑制;因此我們認為葫蘆素B能夠抑制吉非替尼耐藥的NSCLC中異常激活的STAT3信號途徑，從而誘導吉非替尼耐藥NSCLC的凋亡，這種抑制具有選擇性，此機制有可能產生行之有效的吉非替尼耐藥NSCLC的分子靶向治療新策略，從而解決吉非替尼耐藥NSCLC治療的瓶頸問題。

總之，通過葫蘆素B的選擇性抑制作用及其信號分子導向，抑制吉非替尼耐藥NSCLC中異常激活的STAT3信號途徑，誘導吉非替尼耐藥NSCLC的凋亡，有可能產生有效而可行的吉非替尼耐藥NSCLC的分子靶向治療新策略，解決目前臨床中吉非替尼耐藥NSCLC治療中的難題，為該疾病的治療開創新的途徑，為中藥葫蘆素片老藥新用提供理論依據，通過葫蘆酚B的選擇性抑制作用及其信號分子指導，抑制吉非替尼耐藥NSCLC中異常激活的STAT3信號通路。

[參考文獻]

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