基于1H-NMR 的不同基因型煙草的差異代謝物分析

魏克強(qiáng)，楊俊仙，李娟娟，宋 欣

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西大學(xué)經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院，山西太原030006；3.保定幼兒師范高等專科學(xué)校，河北涿州072750）

目前，我國(guó)煙草種質(zhì)的遺傳多樣性水平較低、遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，限制了煙葉品質(zhì)的進(jìn)一步提高。通過遠(yuǎn)緣雜交引進(jìn)外源基因以改良品種、形成新物種和新類型已成為煙草育種的發(fā)展趨勢(shì)[1]。煙葉燃燒后釋放的煙氣富含4 800 余種化學(xué)成分，有1/3 直接來源于煙草本身，其余的是通過燃燒、裂解、蒸餾、冷凝等一系列復(fù)雜的物理化學(xué)過程新產(chǎn)生的[2]，因此，煙草內(nèi)源性物質(zhì)的含量及性質(zhì)直接影響了卷煙制品的安全性與可用性。

基因型是影響煙草化學(xué)成分的主要因素之一。代謝產(chǎn)物是基因表達(dá)的終產(chǎn)物，代謝組學(xué)以相對(duì)分子質(zhì)量1 000 以下的內(nèi)源性小分子為研究對(duì)象，其種類和數(shù)量變化是生物系統(tǒng)對(duì)基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)，日益成為遺傳育種、環(huán)境毒理、疾病診斷、藥物篩選等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3-4]?；诤舜殴舱瘢∟MR）和質(zhì)譜（MS）的代謝組學(xué)新技術(shù)，國(guó)內(nèi)外已對(duì)植物野生種與栽培種、野生型與轉(zhuǎn)基因植株、品種間雜交后代的基因型差異進(jìn)行了相關(guān)研究，表明這是一個(gè)有助于評(píng)價(jià)基因改造效果、篩選優(yōu)良材料的方法[5-8]。魏克強(qiáng)等[9]利用分子標(biāo)記和靶標(biāo)分析技術(shù)揭示了導(dǎo)入白花曼陀羅（Datura metel L.）基因的煙草遠(yuǎn)緣雜交新品種曼陀羅煙與普通煙草（Nicotiana tobacum L.）的基因型差異，發(fā)現(xiàn)莨菪烷型生物堿（東莨菪堿、阿托品）是其差異性代謝產(chǎn)物之一，但尚未對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行整體、全面的分析。基于此，山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境污染與健康風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室利用1H-NMR 技術(shù)結(jié)合主成分分析法（PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）的多元統(tǒng)計(jì)方法，研究了曼陀羅煙及其親本煙草78-04 的差異代謝物，旨在為指導(dǎo)煙草品質(zhì)的遺傳改良、構(gòu)建煙氣毒理的評(píng)價(jià)方法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

供試煙草遠(yuǎn)緣雜交新品種曼陀羅煙及其親本烤煙品種78-04，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室提供。MS 固體培養(yǎng)基（北京索來寶），NMR 試劑重水（美國(guó)Norell）；氘代甲醇、氘代氯仿（德國(guó)Merck）等。Bruker 600-MHz Avance ⅢNMR Spectrometer（德國(guó)布魯克公司），KDC-140HR 型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳），MGC-350HP 智能型人工氣候箱（上海一恒）等。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018 年3—8 月在山西大學(xué)進(jìn)行。

1.2.1 煙草幼苗的培養(yǎng) 挑選顆粒飽滿的種子，于培養(yǎng)皿中先用無菌水浸泡24 h，再用75%乙醇浸泡1 min，10%H2O2浸泡15 min，無菌水沖洗干凈后接種于MS 培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)至種子破皮后，人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)（溫度26 ℃，濕度75%）。

1.2.21H-NMR 的檢測(cè)方法 參考文獻(xiàn)[10]的方法，煙草幼苗培養(yǎng)60 d 后，取新鮮的葉片組織，液氮研磨。真空冷凍干燥后，稱取200 mg，置于10 mL 的玻璃離心管中。加入蒸餾水和甲醇各1.5 mL、氯仿3 mL，室溫下漩渦混勻1 min。將混勻后的樣品置于超聲清洗儀中，超聲提取25 min；室溫下，3 500 r/min 離心25 min。取上清液，減壓濃縮蒸干，對(duì)上層甲醇水相濃縮蒸干物進(jìn)行溶解處理：加入氘代甲醇400 μL與緩沖液400 μL 溶解，然后使用移液槍將圓底燒瓶中的溶液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃，13 000 r/min 離心10 min。取上清液600 μL 于5 mm 核磁管內(nèi)進(jìn)行600-MHz NMR 檢測(cè)，參數(shù)為25 ℃，測(cè)定頻率為600.13 MHz，掃描次數(shù)為64，譜寬為12 345.679 Hz。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將核磁圖導(dǎo)入MestReNova 軟件，對(duì)核磁圖進(jìn)行定標(biāo)（TSP：δ0.00），相位校準(zhǔn)和基線校準(zhǔn)后進(jìn)行積分處理，以δ0.01 對(duì)積分區(qū)間進(jìn)行分段積分，積分區(qū)段為δ0.76～9.34，切除其中甲醇峰δ3.29～3.32。將處理后的數(shù)據(jù)保存。使用SIMCA-P 13.0 軟件對(duì)上述處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)作PCA 和OPLS-DA 分析，找出樣品中的差異性代謝物。

2 結(jié)果與分析

對(duì)分離得到的提取物的核磁圖譜進(jìn)行代謝物指認(rèn)，根據(jù)文獻(xiàn)[7，11]提供的化合物化學(xué)位移、耦合常數(shù)以及核磁數(shù)據(jù)庫，從煙葉甲醇水相的圖譜中共指認(rèn)出18 個(gè)代謝物，主要包括氨基酸類（亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、甘氨酸）、糖類（β-葡萄糖、α-葡萄糖、蔗糖）、有機(jī)酸類（延胡索酸、甲酸）、膽堿等物質(zhì)。然后采用多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步挖掘：在PCA 得分散點(diǎn)圖的基礎(chǔ)上建立OPLS-DA得分圖，以消除組內(nèi)及隨機(jī)誤差，使得數(shù)據(jù)的整體特征和變化規(guī)律更加明顯，提高模型的有效性和解析力。篩選組間的差異性代謝物（圖1）：由得到的OPLS-DA 得分圖和S-PLOT 圖，同時(shí)結(jié)合S-PLOT 圖中VIP 值（＞1）尋找不同基因型煙草中的差異性代謝物，可見曼陀羅煙與78-04 能明顯區(qū)分，其化學(xué)成分差異主要涉及γ-氨基丁酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、甘氨酸等代謝物，尤以氨基酸類最為明顯。

3 討論

在植物代謝組學(xué)研究中，核磁共振波譜技術(shù)（NMR）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS 或LC/MS）是目前最常用的技術(shù)平臺(tái)，主要被應(yīng)用于揭示植物對(duì)環(huán)境擾動(dòng)代謝調(diào)控的生物標(biāo)記物以及植物對(duì)遺傳改變的代謝應(yīng)答、鑒別不同基因型材料的差異?；贕C/MS 的分析顯示，蘋果酸和檸檬酸是辨別不同基因型擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Col0 和C24）最重要的代謝物，葡萄糖和果糖是辨別其雜交一代F1（C24×Col0 和Col0×C24）最重要的代謝物?；?H-NMR 的代謝輪廓分析發(fā)現(xiàn)，色氨酸、甲酸、脯氨酸和蘇氨酸的含量差異與2 個(gè)基因型（褐色籽與黃色籽）埃塞俄比亞芥（Brassica carinata）的耐鹽性差異密切相關(guān)，為生物乙醇材料的篩選提供了依據(jù)。基于1H-NMR 的代謝指紋分析，確定了區(qū)分野生型與表達(dá)水楊酸生物合成基因薩姆遜煙草植株的主要成分是綠原酸、蘋果酸、葡萄糖和蔗糖；野生與栽培胡蘿卜（Daucus carota L.）幼苗的綠原酸、阿魏?？崴岷看嬖诓町?，并表明其雜種后代具有母本遺傳或野生品質(zhì)優(yōu)勢(shì)[5-8]。但這2 種方法各具優(yōu)點(diǎn)和局限性，要對(duì)所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行無偏向性的完整分析，1H-NMR 與GC/MS 相結(jié)合將是比較理想的手段[12]。

茄科煙草屬（Nicotiana）植物的遺傳背景相對(duì)狹窄，栽培煙草品種間的遺傳相似性較高，迫切需要導(dǎo)入有價(jià)值的外源基因來拓展其基因池[13]。通常曼陀羅屬（Datura L.）植物被用于提取莨菪烷型生物堿，具有很高的醫(yī)藥價(jià)值。煙草的化學(xué)成分極其復(fù)雜，小分子代謝物的結(jié)構(gòu)種類繁多、理化性質(zhì)差異巨大、含量極微且動(dòng)態(tài)范圍極寬、時(shí)空分布的差異明顯、相互作用方式多樣。燃燒后產(chǎn)生的煙氣成分更是復(fù)雜多樣，既有提供香氣、吃味和生理作用的物質(zhì)，也有產(chǎn)生雜氣、刺激的物質(zhì)，還有苯并芘、亞硝胺、煙堿等有害物質(zhì)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，基于國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）推薦的毒理學(xué)測(cè)試方法，即細(xì)菌誘變分析（Ames 試驗(yàn)）、細(xì)胞遺傳學(xué)分析（微核試驗(yàn)）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系細(xì)胞毒性分析（中性紅試驗(yàn)）及大鼠慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型，發(fā)現(xiàn)煙氣暴露誘發(fā)的體外毒性效應(yīng)、大鼠吸煙相關(guān)性的肺損傷和COPD 的疾病進(jìn)程等方面的差異可能與不同基因型煙草的差異性化學(xué)組成有關(guān)[14-17]。與78-04 比較，曼陀羅煙的總糖、還原糖、總氮和蛋白質(zhì)含量分別降低19.24%，22.04%，6.34%和9.25%[9]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了18 個(gè)小分子的差異性代謝物，尤以氨基酸類最為明顯，但目前還不清楚它們對(duì)煙草品質(zhì)、健康風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生了哪些影響。傳統(tǒng)的育種方法預(yù)見性差、工作量大，難以快速獲得理想的類型，如何充分利用代謝組學(xué)信息來評(píng)價(jià)基因改造的效果、篩選出優(yōu)良材料還有待于進(jìn)一步研究。