銨硝混合營養對煙草苗期氮代謝酶及內源生長素的影響

宋文靜　宋科　董建新　李永亮　況帥　禚其翠　李帥　梁洪波

摘要：為探究不同硝響應型煙草品種氮素代謝關鍵酶活性對不同銨硝配比的響應，以硝響應度強的煙草品種NC89和硝響應度弱的煙草品種中煙100為供試材料，在控制條件下進行水培處理，研究3種銨硝配比對2個品種煙株生物量積累和氮素吸收的影響，以及氮素同化過程中相關酶活性和內源生長素含量對不同硝銨配比的響應。結果表明，銨硝比50/50處理可顯著促進不同硝響應型煙草品種生物量的增加和氮素積累;硝響應度強煙草品種NC89低硝處理地上部硝酸還原酶（NR）活性顯著高于銨硝比50/50處理，而根系中的差異則相反，硝響應度弱煙草品種中煙100不同處理下NR活性無顯著差異;中煙100和NC89煙株體內谷氨酰胺合成酶（GS）活性整體隨銨態氮比例的增加而提高;中煙100和NC89根系中谷氨酸脫氫酶（GDH）活性均以全硝處理最低，中煙100較NC89具有更高的GDH活性來緩解高濃度NH4+;中煙100和NC89地上部和根系的生長素含量均表現為最佳銨硝比50/50處理>全硝處理>低硝處理，中煙100全硝處理和低硝處理根系生長素含量較銨硝比50/50處理的降幅與地上部基本一致，而硝響應度強煙草品種NC89全硝處理和低硝處理根系中生長素含量較銨硝比50/50處理的降幅遠大于其地上部。由此推論，不同銨硝營養下，不同硝響應型煙草品種氮代謝酶及內源生長素存在響應差異。

關鍵詞：銨硝配比;煙草;氮代謝酶活性;內源生長素

中圖分類號： S572.06文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0100-05

如何提高煙葉品質是烤煙生產上的關鍵問題，煙葉的煙堿含量和吸食生理強度與煙葉中的氮素含量有關，而煙葉中的氮素含量不僅受土壤中氮素供應量的影響，且取決于煙株對氮素的吸收利用效率。烤煙是喜硝作物，但適當增銨卻能促進烤煙的干物質積累和根系發生與伸長，這可能與不同銨硝營養引起植株體內氮代謝相關酶活性發生變化有關。硝酸還原酶（NR）是NO3-進行同化過程的關鍵酶。谷氨酰胺合成酶（GS）是將無機態氮催化合成為有機態氮的關鍵酶[1-2]，根系直接吸收NO3-在NR的作用下還原成NO2-，NO2-在質體中被亞硝酸還原酶（NiR）還原成NH3，形成的NH3在GS的作用下形成氨基酸，該過程需要消耗大量糖類來提供碳架。李彩鳳等研究發現，不同氮素形態處理的甜菜體內氮同化相關酶活性不同，其中硝酸還原酶活性隨硝態氮比例的增大而升高[2]，郝敬虹等[3]也得到相似的試驗結果。Song等研究發現，與單一NO3-營養相比，在銨營養增加時，水稻苗期根系NR活性提高[4-5]，而銨硝營養處理對水稻苗期地上部NR活性的影響與根系一致[6-7]。Magalhes等研究指出，單一銨態氮源處理時，玉米植株中的GS活性隨著NH4+濃度的升高而增大，且地上部高于地下部[8]。張宏紀等研究表明，在同一施氮水平下，GS活性隨銨硝比例的增大而增大[9]。劉衛群等研究發現，單純對烤煙施銨態氮的處理，煙株體內NR、GS活性較高[10]。谷氨酸脫氫酶（GDH）作為參與植物同化氮素的主要酶之一，在植物氮代謝中起著重要作用。現有研究推測，GDH可能能夠有效緩解植物的銨毒害作用[11]。在不同植物中，GDH對外界NH4+有不同的反應濃度，因此不同植物能夠適應的NH4+濃度不同，這可能與GDH自身結構上的差異以及在不同植物體中產生的同工酶有關[12]。

生長素（IAA）是植物體最重要的內源激素，對植物根系的生長發育具有重要作用。王波等對生菜的研究發現，銨硝混合營養處理比單一硝營養處理的IAA含量高[13]。郭紅祥等通過水培試驗發現，不同氮素形態處理的煙苗IAA含量達到顯著差異水平[14]。說明植物內源生長素含量對不同銨硝營養的響應不同。

目前關于不同硝響應型煙草品種氮代謝關鍵酶對不同銨硝配比的響應差異研究較少，因此本試驗采用水培方法，研究中煙100和NC89在不同銨硝配比下氮代謝關鍵酶活性和內源生長素含量的差異，以期通過氮代謝途徑關鍵酶活性探明烤煙對不同銨硝配比的響應機制。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗于2016年在中國農業科學院煙草研究所試驗場溫室進行。

1.2供試材料

NC89是美國1976年雜交育成的品種，中煙100是中國煙草遺傳育種研究（北方）中心選育的優質多抗烤煙新品種，均是國內主栽品種。

1.3試驗設計

將消毒后的NC89和中煙100裸種分別播種于塑料培養盒中，待幼苗出土25 d后，選取長勢一致的煙苗，用清水洗凈根部基質，用海綿包裹煙苗根莖結合處并固定在Karat board（KT板）上，轉移至裝有15 L清水的塑料圓盆式周轉箱中培養3 d，每個圓盆式周轉箱（pot）培養3株煙苗，緩苗后再用不含氮素的霍格蘭營養液培養2 d，然后進行不同銨硝配比處理。改良后的霍格蘭營養液成分為：N 3.75 mmol/L、P 0.25 mmol/L、K 2.00 mmol/L、Mg 0.25 mmol/L、Ca 3.75 mmol/L、Fe（Fe-EDTA）20.00 μmol/L、Mn 9.00 μmol/L、B 46.00 μmol/L、Zn 0.80 μmol/L、Cu 0.30 μmol/L、Mo 0.50 μmol/L。

對NC89和中煙100設置3個銨硝配比處理，分別為NO3--N 3.75 mmol/L（NH4+/NO3-=0/100，全硝處理）;NH4+-N和NO3--N各1.875 mmol/L（NH4+/NO3-=50/50，最佳銨硝比處理）;NH4+-N 3.65 mmol/L，NO3--N 0.10 mmol/L（NH4+/NO3-=97/3，低硝處理）。其中N以NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3的形式加入。營養液每2 d更換1次，并用0.1 mol/L的HCl將pH值調至6.0。自煙苗處理當天起，第7天取樣進行測定。

1.4測定內容與方法

1.4.1生物量和氮含量測定

將煙株樣品分部位置于80 ℃烘箱48 h，然后用千分之一天平分別稱其質量并記錄。總氮含量參照YC/T 33—1996《煙草及煙草制品 總氮的測定 克達爾法》，采用全自動凱氏定氮儀進行測定。

1.4.2氮代謝酶含量測定

NR活性參照李合生的方法[15]測定。GS活性參照段英華等的方法[16]測定。GDH活性參照Groat等的方法[17]測定。

1.4.3生長素濃度測定

采用酶聯免疫法測定IAA濃度。

1.5數據分析

采用Excel 2007軟件進行數據整理和作圖，采用SAS 9.3數據分析軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1銨硝混合營養對煙草苗期生物量的影響

由表1可知，處理后第7天，最佳銨硝比處理中煙100和NC89的地上部和根系干質量均顯著大于低硝處理，硝響應度弱煙草品種中煙100全硝處理與低硝處理無顯著差異，而NC89 3個處理間均達到顯著差異水平。說明與全硝、低硝營養條件相比，最佳銨硝比更能促進煙苗地上部和根系干物質的積累。另外，與硝響應度弱煙草品種中煙100相比，硝響應度強煙草品種NC89處理間差異更大，說明NC89對銨硝營養更加敏感。

2.2銨硝混合營養對煙草苗期氮積累量的影響

由圖1可知，處理第7天，不同處理中煙100、NC89的氮積累量存在差異，2個品種最佳銨硝比處理的氮含量均顯著高于其他處理。不同硝響應度煙草品種氮素積累量趨勢一致，均為最佳銨硝比處理顯著大于全硝、低硝處理，且全硝處理和低硝處理無顯著差異。說明最佳銨硝比營養條件能夠有效促進煙苗對氮素的吸收利用。

2.3銨硝混合營養對煙草苗期NR活性的影響

從圖2可以看出，在不同銨硝配比下，硝響應度弱煙草品種中煙100地上部和根系NR活性無顯著差異，說明在不同銨硝營養環境中，中煙100始終保持較為穩定的硝同化能力。硝[CM（25]響應度強煙草品種NC89地上部與根系NR活性變化趨勢不一致，由于大部分NO3-在根系中被還原，因此根系中的NR活性更能代表幼苗的硝態氮同化能力，與低硝處理相比，全硝處理和銨硝比50/50處理可促進根系NR活性的提高，其中銨硝比50/50處理的促進效果達到顯著水平，這與Alexander等的研究結果[5]一致。

2.4銨硝混合營養對煙草苗期GS活性的影響

由圖3可知，中煙100和NC89的GS活性整體隨著NH4+濃度的升高而增大，這與劉衛群等的研究結果[10]一致;且2個品種全硝處理與低硝處理地上部和根系中的GS活性差異均達到顯著水平。與硝響應度弱煙草品種中煙100相比，硝響應度強煙草品種NC89處理間差異更大，3個處理間地上部和根系中的GS活性均達到顯著差異水平。說明在不同銨硝配比條件下，不同煙草品種的GS活性產生的響應程度不同。

2.5銨硝混合營養對煙草苗期GDH活性的影響

根據吳頌如等的研究[12]，不同植物能夠適應的NH4+濃度不同，這可能與GDH自身結構上的差異以及在不同植物體中產生的同工酶有關。筆者所在實驗室在前期試驗中發現，烤煙品種NC89對不同銨硝配比有不同的響應[18]，因此猜測，不同硝響應型煙草品種的GDH活性對相同NH4+濃度有不同的響應。由圖4可知，不同硝響應度煙草品種地上部GDH活性均無顯著差異，根系中的GDH活性均以全硝處理最低，這可能是由于大部分NH4+在根系中累積，引起根系中的GDH活性變化。在全硝處理、銨硝比50/50處理和低硝處理下，硝響應度弱煙草品種中煙100根系GDH活性分別比NC89高171.4%、91.3%和42.9%，因此中煙100具有更高的GDH活性來緩解高濃度NH4+脅迫。

2.6銨硝混合營養對煙草苗期內源生長素的影響

從圖5可看出，不同硝響應度煙草品種地上部和根系生長素含量均表現為銨硝比50/50處理>全硝處理>低硝處理。與銨硝比50/50處理相比，中煙100全硝處理地上部和根系生長素含量分別降低13.3%和12.0%，中煙100低硝處理地上部和根系生長素含量分別降低27.1%和32.8%。與NC89銨硝比50/50處理相比，NC89全硝處理在地上部和根系生長素含量分別降低9.1%和40.0%，NC89低硝處理在地上部和根系生長素含量分別降低21.0%和 62.5%。與銨硝比50/50處理相比，全硝、低硝處理的煙草品種中煙100地上部與根系中生長素含量的降幅基本相當，而硝響應度強煙草品種NC89根系中生長素含量的降幅遠大于其地上部，說明NC89全硝、低硝處理均影響其生長素由地上部向根系運輸。

3結論與討論

饒學明研究認為，銨硝比為50/50時烤煙根系干物質積累量顯著增加[19]。本研究結果顯示，不同硝響應度煙草品種全硝、低硝處理地上部和根系氮積累量均顯著低于銨硝比50/50處理，說明銨硝比50/50處理可顯著促進氮素的積累。NR是植物體內一種重要的氮代謝酶，外源供應氮素形態影響其活性，并且作物種類不同其變化趨勢也不同。由于大部分NO3-在根系中被還原，因此根系中的NR活性更能代表硝態氮的同化能力。本研究表明，硝響應度強煙草品種NC89地上部與根系NR活性隨銨硝比的變化趨勢不一致，其中銨硝比50/50處理根系中NR活性顯著高于低硝處理;不同處理間硝響應度弱煙草品種中煙100地上部和根系的NR活性沒有呈現出顯著差異。因此不同硝濃度條件下，硝響應度強煙草品種NC89根系中的NR活性能產生更大幅度變化。

GS對NH4+有著高度的親和性，可以催化低濃度的NH4+同化。本研究發現，2個品種低硝處理地上部和根系GS活性都顯著高于全硝處理，且GS活性整體隨著銨硝比的增加而增加，但地上部低硝處理比銨硝比50/50處理的增幅水平小于銨硝比50/50處理比全硝處理的增幅。這可能存在3個方面的原因，（1）NH4+經GS催化合成的谷氨酰胺對GS具有負反饋作用，谷氨酰胺含量達到一定程度時能夠下調GS活性;（2）低硝處理下NH4+作為底物，濃度趨于飽和時，單位時間內同化NH4+的增速減慢;（3）在同化NH4+的過程中，會產生H+，使細胞內pH值下降，進而抑制GS活性。另外，與全硝處理相比，硝響應度強煙草品種NC89低硝處理GS活性增幅明顯大于中煙100;在全硝處理下，NC89地上部GS活性明顯低于中煙100。可見GS活性因品種硝響應度的不同而有很大差異。在后續研究中，可通過測定GS相關基因的表達來進一步探究煙草GS活性對不同銨硝配比的響應機制。

GDH作為氮素代謝過程中的一個關鍵酶，它能夠催化合成或分解谷氨酸。汪健飛研究表明，GDH的主要功能在于分解谷氨酸[20]。相關研究發現，GDH能夠促進大豆吸收利用銨態氮[21]。本研究結果表明，中煙100和NC89不同處理下地上部GDH活性沒有顯著差異，與全硝處理相比，銨硝比50/50處理根系中GDH活性具有較大幅度的提高。說明外源NH4+能夠有效誘導GDH活性的提高，且在NH4+濃度較高時，GDH活性的提高有利于降低NH4+在植物體內的濃度。與中煙100相比，硝響應度強煙草品種NC89各處理GDH活性較低，這可能是其在不同硝營養下響應強烈的原因之一。

宋文靜研究發現，與全NH4+營養相比，增NO3-營養處理顯著增加了水稻地上部、韌皮部以及根系中的生長素含量[22]，說明增硝營養促進了生長素的合成以及向根系的極性運輸。盧穎林在研究番茄增硝營養時發現，隨著營養液中NH4+的增加，番茄木質部傷流液中的細胞分裂素（CTK）和IAA總累計量顯著降低[23]。以上研究結果說明，植物內源生長素對不同銨硝營養存在不同響應。在本試驗中，與銨硝比50/50處理相比，不同硝響應度煙草品種全硝處理和低硝處理根系生長素含量均有所下降，其中低硝處理地上部和根系中的降幅均達到顯著水平。在2品種之間，NC89全硝、低硝處理根系中生長素含量降幅較大。由于生長素外輸載體（PIN）家族在根系生長素極性運輸過程中起到重要作用，因此在后續研究中，可對PIN家族基因進行PCR分析，研究其表達差異，明確在不同銨硝營養下煙草內源生長素存在響應差異且品種間存在響應差異的機制。

參考文獻：

[1]趙平，孫谷疇，彭少麟. 植物氮素營養的生理生態學研究[J]. 生態科學，1998（2）：39-44.

[2]李彩鳳，馬鳳嗚，趙越，等. 氮素形態對甜菜氮糖代謝關鍵酶活性及相關產物的影響[J]. 作物學報，2003，29（1）：128-132.

[3]郝敬虹，易旸，尚慶茂，等. 水楊酸處理對干旱脅迫下黃瓜幼苗氮素同化及其關鍵酶活性的影響[J]. 園藝學報，2012，39（1）：81-90.

[4]Song W J，Liu S J，Meng L，et al. Potassium deficiency inhibits lateral root development in tobacco seedlings by changing auxin distribution[J]. Plant and Soil，2015，396（1/2）：163-173.

[5]Alexander K G，Miller M H，Beauchamp E G. The effect of an NH4+-enhanced nitrogen source on the growth and yield of hydroponically grown maize （Zea mays L）[J]. Journal of Plant Nutrition，1991，14（1）：31-44.

[6]汪和廷，董慧，齊龍昌，等. 種植方式及施氮量對水稻灌漿初期氮代謝關鍵酶活性和產量性狀的影響[J]. 中國生態農業學報，2015，23（9）：1210-1214.

[7][JP3]羅鳳，盧永恩，楊猛，等. 氮脅迫對水稻營養生長期氮代謝及相關基因表達量的影響[J]. 華中農業大學學報，2012，31（1）：16-22.

[8]Magalhes J R，Ju G C，Rich P J，et al. Kinetics of 15NH4+ assimilation in Zea mays preliminary studies with a glutamate dehydrogenase （GDH1） null mutant[J]. Plant Physiology，1990，94（2）：647-656.

[9]張宏紀，馬鳳鳴，李文華，等. 不同形態氮素對甜菜谷氨酰胺合成酶活性的影響[J]. 黑龍江農業科學，2001（6）：7-10.

[10]劉衛群，岳俊芹，汪慶昌，等. 不同氮素形態及配比對烤煙葉片氮代謝的影響[J]. 河南農業科學，2004（6）：53-55.

[11]黃國存，田波. 高等植物中的谷氨酸脫氫酶及其生理作用[J]. 植物學通報，2001，18（4）：369-401.

[12]吳頌如，周燮，徐義俊. 水稻與黃瓜耐銨性生理分析[J]. 南京農業大學學報，1988，11（2）：17-23.

[13]王波，耿士均，劉刊，等. 不同銨硝配比營養液對生菜內源激素的影響[J]. 湖北農業科學，2012，51（19）：4293-4298.

[14]郭紅祥，劉衛群，岳俊勤，等. 烤煙根系激素水平、GS、PMT對氮素形態的響應[J]. 華北農學報，2006，21（1）：72-75.

[15]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[16]段英華，張亞麗，沈其榮，等. 增硝營養對不同基因型水稻苗期氮素吸收同化的影響[J]. 植物營養與肥料學報，2005，11（2）：160-165.

[17]Groat R G，Vance C P. Root nodule enzymes of ammonia assimilation in alfalfa （Medicago sativa L.） developmental patterns and response to applied nitrogen[J]. Plant Physiology，1981，67（6）：1198-1203.

[18]宋科，梁洪波，徐旭光，等. 不同銨硝配比對烤煙根系形態及氮磷鉀吸收的影響[J]. 中國煙草科學，2017，38（2）：8-13.

[19]饒學明. 不同氮素形態配比對烤煙根系生長發育的影響[D]. 鄭州：河南農業大學，2003.

[20]汪建飛. 營養液不同銨硝比對菠菜產量和品質影響的機理研究[D]. 南京：南京農業大學，2007.

[21]董雅致，徐克章，李大勇，等. 不同氮素光合效率大豆品種葉片保護酶活性對施氮水平的響應[J]. 吉林農業大學學報，2015，37（4）：395-401，423.

[22]宋文靜. 增硝營養調控不同硝響應型水稻品種根系生長的機制研究[D]. 南京：南京農業大學，2012.

[23]盧穎林. 銨硝營養影響番茄幼苗生長和氮素代謝的生理機制[D]. 南京：南京農業大學，2009.