新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌多樣性研究

方雷　陳根元　劉利林　周小玲

摘要：運用PCR-DGGE技術研究新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸中固相食糜細菌組成多樣性。選用3頭成年、健康新疆驢，自由采食90%稻草+10%精料混合日糧，舍飼30 d后屠宰、分段取樣備用。經過微生物基因組提取、目標片段擴增、變性梯度凝膠電泳、圖像分析和數據處理，結果表明，不同腸道固相食糜細菌條帶組成上有相似區域，也有各自的特異條帶，而同一腸道段的個體樣本間的細菌條帶具有較高相似性，且盲腸固相食糜細菌的Shannon-Wiener指數、Simpson指數最大，與腹結腸差異不顯著，但都分別顯著高于背結腸。新疆驢盲腸固相食糜細菌多樣性最為豐富，腹結腸次之，背結腸相對最弱。

關鍵詞：新疆驢;盲腸;腹結腸;背結腸;固相食糜;細菌多樣性

中圖分類號： S822.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0176-03

驢屬于單胃草食動物，與豬禽等單胃動物不同，具有發達的盲腸和結腸，這是驢重要的消化器官。腸道內長期寄居著種類豐富、數量龐大的微生物，彼此間協同作用發酵、降解消化道食糜，產生揮發性脂肪酸，為宿主提供養分。有關研究結果表明，驢對稻草、麥秸、玉米秸稈日糧中的中性洗滌纖維（NDF）消化率為40%～50%，與牛羊等反芻動物對這3種秸稈日糧的NDF消化能力相當，說明驢的盲腸、結腸的腸道微生物對秸稈粗飼料有較強的降解能力[1]，其功能類似于反芻動物的瘤胃。反芻動物的瘤胃微生物主要黏附在飼料顆粒上、存在于瘤胃液中和附著于瘤胃內壁上[2]，且瘤胃固相食糜中的微生物數量高于液相，是瘤胃中的主要功能微生物[3-5]。瘤胃微生物的多樣性受飼料組成[6]、宿主遺傳背景[7]和環境等因素影響[8];反芻動物的瘤胃、網胃、瓣胃和皺胃4個胃室中菌群多樣性也不一樣，呈現先高后低再升高的趨勢[9]。驢的盲腸、腹結腸、背結腸是日糧中纖維素、半纖維素等結構性碳水化合物降解的重要場所，不同消化部位的固相食糜細菌多樣性如何變化是本研究的切入點。

1材料與方法

1.1試驗動物、時間及地點

試驗于2017年6月5日至7月5日在塔里木大學動物科學學院試驗養殖基地進行。試驗選用3頭成年、健康、3～4歲新疆驢，舍飼喂以含有90%粉碎稻草和10%精料（70%玉米粉+30%棉粕）的混合日糧，自由采食、飲水，飼養30 d。

1.2樣品處理

飼養結束后，屠宰前1 d晚上禁食、供水，屠宰前先用鈍器打擊頭部致暈，立即頸動脈放血、開膛、暴露內臟;找到“逗號”狀盲腸，隨后向后繼續找到膨大腹結腸、膨大背結腸，用繩子扎緊各段間狹小接口，水平放置，從各腸道段中部取樣;分別采集盲腸、腹結腸、背結腸食糜，并用4層滅菌紗布過濾，將過濾后的固相食糜迅速收集于數個2 mL滅菌指形管中，立即投入液氮罐于實驗室，分類保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3食糜微生物總DNA提取

參照Kang等[10]和Laure等[11]的方法洗脫固相食糜上附著的微生物，用天根生物技術有限公司微生物基因組DNA提取試劑盒（DP328）提取微生物基因組總DNA，具體步驟按說明書操作。

1.4目標片段擴增及檢測

試驗采用細菌16S rDNA的V3區通用引物對目標片段進行擴增，上游引物HDA1-GC序列為：5′-[JP9]CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，下游引物HDA2序列為：5′-[JP9]GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′。以上引物由上海生工生物技術有限公司合成，可擴增長約200 bp的目標片段。

PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環。PCR產物由 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5變性梯度凝膠電泳

試驗中DGGE采用10%聚丙烯酰胺凝膠，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺比例為37.5 ∶1，變性劑濃度梯度為45%～60%。電泳采用Dcode DGGE系統（Bio-Rad，美國），在 0.5×TAE緩沖液中、60 ℃恒溫下進行，200 V預電泳10 min，85 V電泳16 h。電泳結束后，用0.5 μg/mL的EB溶液染色30 min，用凝膠成像系統（Gel DOCTM XR+，Bio-Rad美國）檢測、拍照。

1.6圖譜處理與數據分析

用Quantity One 4.62軟件對DGGE圖譜進行分析，將各泳道條帶光密度值計算、輸出用于計算Simpson指數和Shannon-Wiener指數[12-13]，采用SAS 8.0軟件對細菌多樣性指數進行Duncans檢驗和統計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。用NTSYSpc 2.10S對圖譜條帶聚類分析。

D=1-∑si=1P2i;

H′=-∑si=1PilnPi。

式中：Pi為某樣品中某1條帶光密度值占該樣品中總光密度值的比率，D為Simpson指數，H′為Shannon-Wiener指數。

2結果與分析

2.1新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜微生物總DNA

新疆驢不同段腸道固相食糜微生物總DNA提取結果見圖1。由圖1可見，盲腸、腹結腸、背結腸各代表樣品分別在 1～9 泳道均有明亮條帶，與marker相比，條帶大小在2.3 ku左右，有稍許拖尾，比較完整，D260 nm/D280 nm比值為1.71，可以用作后續PCR模板。

2.2新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌16S rDNA V3區PCR擴增產物

以新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜微生物總DNA為模板，細菌16S rDNA V3區通用引物進行PCR擴增，經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳、染色、拍照，結果表明，不同腸道固相食糜各樣本均獲得整齊、明亮的目標PCR產物，大小為 200 bp（圖2），符合引物擴增預期產物結果，可以用于后續變性梯度凝膠電泳。

2.3新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌16S rDNA V3區PCR-DGGE指紋圖譜

新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌V3區PCR擴增產物經45%～60%變性梯度凝膠電泳、染色、照相，結果表明，各腸道段各樣本在各自泳道均出現豐富、明亮、清晰條帶，同一腸道段樣本間有大量相似條帶，不同腸道間既有部分相似條帶，也有所屬腸道段的特異條帶（圖3）。

2.4新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌DGGE指紋圖譜聚類分析

新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌PCR-DGGE圖譜聚類分析結果見圖4。各段腸道固相食糜細菌條帶都以高于0.93的相似性分別聚合成盲腸（1、2、3）、腹結腸（4、5、6）和背結腸（7、8、9）三大類群，腹結腸和背結腸又以0.67左右的相似性聚合成大結腸類群，最后再以0.56相似性和盲腸細菌條帶聚合成一大簇。

2.5新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌多樣性指數分析

新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜細菌PCR-DGGE凝膠圖片經Quantity One軟件對各泳道條帶光密度值輸出、多樣性指數計算和SPSS統計分析后，結果（表1）顯示，新疆驢盲腸固相食糜細菌的Shannon-Wiener指數和Simpson指數均為最大，分別為3.209和0.947，與腹結腸差異不顯著，但均分別極顯著高于背結腸（P<0.01）。

3討論與結論

反芻動物瘤胃微生物的存在方式，主要以黏附固相飼料顆粒、游離于瘤胃液中和附著于瘤胃內壁上，其中固相食糜黏附微生物占瘤胃微生物總數的50%～70%[14]，以大量纖維降解菌為主，纖維素降解也是瘤胃代謝的限速步驟[15]。通過表1 細菌多樣性指數來看，盲腸固相食糜的Shannon-Wiener和Simpson指數值都是最大，分別為3.209和0.957，與腹結腸的3.168和0.927相比差異不顯著，但都分別極顯著高于背結腸的2.950和0.915（P<0.01）。也就是說，盲腸固相食糜上附著的細菌種類更加豐富，腹結腸次之，背結腸相對最弱;瘤胃微生物在降解日糧過程中，主要包括附著和酶解2個過程，其中附著過程是瘤胃微生物降解日糧的前提[16-17]，靠附著微生物間協同作用降解食糜;推測盲腸在對固相食糜顆粒降解的作用要強于腹結腸，強于背結腸;可能一方面盲腸是驢大腸微生物發酵降解食糜重要的起始段，胃、小腸等消化液消化后，食糜中不易被消化或逃脫的易消化養分首先來到盲腸進行微生物降解，食糜中的養分組成和含量有利于盲腸微生物的生長繁殖，使其食糜附著細菌多樣性更好;另一方面，隨著盲腸、腹結腸和背結腸微生物對食糜的逐級降解，食糜中易被利用和能被利用的養分也越來越少，也導致了固相食糜上附著的細菌多樣性逐漸降低。

從新疆驢盲腸、腹結腸和背結腸固相食糜指紋圖譜（圖3）可以看出，在相同試驗條件下，不同消化道段都獲得了較豐富的細菌條帶，有共同、特異和很亮的優勢細菌條帶，但試驗中均未回收、克隆和測序，無法獲知其分類信息;從聚類信息（圖4）上看，各不同腸道處理內的細菌條帶組成都有0.9以上的相似系數，而驢的不同腸道處理間只有0.56的相似系數。本試驗中，我們對新疆驢盲腸、腹結腸、背結腸固相食糜附著細菌多樣性有了初步認識，這些不同消化道微生物差異表現在微生物什么分類水平上，是什么原因造成的仍需進一步研究和探討。

新疆驢的相同腸道段固相食糜細菌組成具有較高的相似性，不同腸道段間細菌組成有所差異;盲腸固相食糜的細菌多樣性最為豐富，腹結腸次之，背結腸相對最弱。

參考文獻：

[1]方雷，礦理揚，牛志濤. 新疆驢對4種秸稈日糧采食與消化的研究[J]. 新疆農業大學學報，2009，32（3）：45-48.

[2]Mcallister T A，Bae H D，Jones G A，et al. Microbial attachment and feed digestion in the rumen[J]. J Ainm Sci，1994，72：3004-3018.

[3]馮薇，王加啟，劉開朗，等. 運用PCR-DGGE分析比較瘤胃中不同飼料固相黏附微生物區系[J]. 畜牧獸醫學報，2010，41（12）：1556-1562.

[4]Peter R M，Forster R J，Yang W，et al. Characterization of rumen bacterial diversity and fermentation parameters in concentrate fed cattle with and without forage[J]. Journal of Applied Microbiology，2012，112（6）：1152-1162.

[5]Huws S A，Lee M R，Muetzel S M，et al. Forage type and fish oil cause shifts in rumen bacterial diversity[J]. FEMS Microbiology Ecology，2010，73（2）：396-407.

[6]吳小燕，彭全輝，王之盛，等. 不同蛋白質飼料對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物數量的影響[J]. 動物營養學報，2014，26（11）：3298-3306.

[7]Benson A K，Kelly S A，Legge R，et al. Individuality in gut microbiota com position is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（44）：18933-18938.

[8]Uyeno Y，Sekiguchi Y，Tajima K，et al. An r-RNA-based analysis for evaluating the effect of heat stress on the rumen microbial com position of Holstein heifers[J]. Anaerobe，2010，16（1）：27-33.

[9]曾燕，曾東，倪學勤，等. 應用PCR-DGGE技術比較綿羊瘤胃、網胃、瓣胃和皺胃菌群的多樣性[J]. 動物營養學報，2015，27（1）：298-304.

[10]Kang S H，Denman S E，Morrison M I. An efficient RNA extraction method for estimating gut microbial diversity by polymerase chain reaction[J]. Current Microbiology，2009，58（5）：464-471.

[11]Larue R，Yu Z T，Parisi V A，et al. Novel microbial diversity adherent to plant biomass in the herbivore gastrointestinal tract，as revealed by ribosomal intergenic spacer analysis and rrs gene sequencing[J]. Environmental Microbiology，2005，7（4）：530-543.

[12]崔振亮，孟慶翔，吳浩，等. PCR-DGGE技術研究青貯桑葉對肉牛瘤胃細菌區系的影響[J]. 飼料研究，2011（1）：1-4.

[13]許晴，張放，許中旗，等. Simpson指數和Shannon-Wiener指數若干特征的分析及“稀釋效應”[J]. 草業科學，2011，28（4）：527-531.

[14]Yang W，Beauchemin K，Rode L. Effect of dietary factors on distribution and chemical composition of liquid-or solid-associated bacterial populations in the rumen of dairy cow[J]. Journal of Animal Science，2001，79（10）：2736-2746.

[15]Koike S，Yoshitani S，Kobayashi Y，et al. Phylogenetic analysis of fiber-associated rumen bacterial community and PCR detection of uncultured bacterial[J]. FEEMS Microbiol Lett，2003，229（1）：23-30.

[16]Michalet-Doreau B，Fernandez I，Fonty G. A comparison of enzymatic and molecular approaches to characterize the cellulolytic microbial ecosystems of the rumen and the cecum[J]. Journal of Animal Science，2002，80（3）：790-796.

[17]Merry R，Mcallan A. A comparison of the chemical composition of mixed bacteria harvested from the liquid and solid fractions of rumen digest[J]. British Journal of Nutrition，1983，50（03）：701-709.