工礦復墾區大豆根際微生物多樣性對施肥制度的響應

張變華　靳東升　郜春花　郜雅靜　李建華

摘要：選取山西省古交屯蘭工礦復墾區為研究對象，設置4個施肥處理，即對照處理（CK）、無機肥處理（F）、有機肥處理（O）、有機無機配施處理（OF），將傳統與現代微生物技術相結合，分析比較了工礦復墾區苗期大豆根際微生物多樣性對施肥制度的響應。結果顯示，傳統微生物培養法表明不同施肥處理下大豆苗期根際微生物細菌、放線菌、真菌數量差異顯著（P<0.05），細菌、放線菌數量由大到小順序均為OF>O>F>CK，真菌數量由大到小順序為O>F>OF>CK;Biolog-ECO分析發現香農-維納指數由大到小順序為OF>O>F>CK，均一度指數順序為O>OF>F>CK，OF處理下大豆根際微生物多樣性指數與CK處理差異顯著，香農維納指數由大到小順序為OF>O>CK>F，OF處理下大豆根際微生物活性高，代謝功能強;16S rDNA分析表明，OF處理下大豆根際微生變形菌門（Proteobacteria）豐度最高，且與O處理大豆根際微生物具有相似親緣性屬，而CK處理下大豆根際微生物綠彎菌門（Chloroflexi）與酸桿菌門（Acidobacteria）豐度最高，與F處理下大豆根際微生物具有相似親緣性屬。總體來看，大豆根際微生物多樣性對施肥的響應變化明顯，OF處理與CK對照處理差異顯著。

關鍵詞：工礦復墾區;根際微生物多樣性;大豆;施肥

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0248-04

土壤微生物參與土壤有機質分解、養分轉化與循環等多種生化過程，是評價土壤質量優劣的重要指標[1]。而工礦復墾區內土壤有機質含量低，團聚體少，微生物活性差，提高礦區復墾土壤質量可以緩解我國人均耕地少、質量差的現狀，保持農業可持續發展。根際是連接植物、土壤和微生物的紐帶，根際微生物繁殖速度較快、數量龐大、代謝旺盛，在土壤有機質的轉化、提供植物養料、維持土壤肥力等方面都具有重要作用[2-4]。當前已有許多研究表明，豆科植物是改良土壤質量的先鋒物種，對于生態重建有重要意義[5-7];在植物根際土壤理化性質、微生物多樣性、土壤酶活性等方面[8-10]已有許多研究，但是在工礦復墾區開展植物根際微生物評價研究較少[11-16]，對于山西工礦復墾區豆科植物根際生物學性質的相關研究更少。山西作為煤炭大省，復墾面積廣;因此，本試驗將山西省古交屯蘭礦區復墾地作為試驗區，利用傳統微生物培養法、Biolog-ECO和16S rDNA相結合的方法，從微生物種類、數量、代謝功能等多樣性的視角分析評價工礦復墾區大豆根際微生物對施肥制度的響應特征，研究豆科植物種植下根際土壤微生物多樣性特點，旨在為今后礦區復墾與生態重建技術研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1研究區概況

試驗區位于山西省古交屯蘭工礦復墾區，該區于2014年復墾為農田，目前仍處于復墾初期，年均氣溫約9.5 ℃，年均降水量約460 mm，2017年種植豆科植物大豆。本試驗設置4個施肥處理：對照處理（CK）、無機肥處理（F）、有機肥處理（O）、有機無機配施處理（OF）。CK處理施肥量為0，其他處理按照等氮量施肥150 kg/hm2，無機肥為復合肥，其中氮、五氧化二磷、氧化鉀質量比（N ∶P2O5 ∶K2O）為=18 ∶12 ∶10，有機肥施用平遙國青（由平遙縣國青同盈禽業有限公司生產，有機質含量53.48%，含氮2.2%），OF處理施肥量為1/2有機肥加1/2無機肥。

1.2根際土壤取樣

于2017年6月9日在大豆生長季苗期，劃定小區2 m×2 m，采用抖落法[17]在不同施肥處理下選擇大小相似的大豆8～10株，每個處理3次重復。用毛刷輕輕地刷下0～5 mm 的根際土，將其收集在無菌塑料袋中，然后放入裝有冰袋的保溫箱內帶回實驗室進行室內分析化驗。

1.3試驗方法

1.3.1傳統微生物培養根際土壤細菌、放線菌、真菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養基、高氏改良培養基、孟加拉紅培養基進行培養。

1.3.2Biolog-ECO稱取10 g根際土壤，放入滅菌的裝有90 mL濃度為0.85% NaCl的帶玻璃珠的三角瓶中，然后以250 r/min在搖床上充分震蕩30 min，10倍稀釋2次后，吸取稀釋后的150 μL土壤溶液加入到Biolog-ECO的96個孔中，然后放入培養箱28 ℃恒溫培養，利用Biolog分析儀每隔24 h讀取各孔的吸光度，連續測7 d。

1.3.316S rDNA高通量測序由上海派森諾生物公司對植物根際進行微生物組DNA提取，包括目標片段PCR擴增、產物回收純化、熒光定量等，使用MiSeq測序儀測定大豆根際微生物V3-V4區的操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）。

1.4統計分析

利用Excel、SPSS、R軟件對所測數據進行方差與聚類分析。

2結果與分析

2.1工礦復墾區大豆根際微生物數量對施肥制度的響應特征

從圖1可以看出，不同施肥處理下，工礦復墾區大豆根際細菌數量差異顯著，從大到小順序為OF>O>F>CK;其中，OF處理下大豆根際細菌數量最多，顯著高于其他處理;說明施肥利于工礦復墾區大豆根際微生物細菌數量的增加，且配施有機無機的處理對增加根際細菌數量的效果最好。

從圖2可以看出，不同施肥處理下大豆根際放線菌數量差異顯著，從大到小順序為OF>O>F>CK;其中，OF處理下大豆根際放線菌數量最多，顯著高于其他處理;說明施肥利于工礦復墾區大豆根際微生物放線菌數量的增加，且OF處理下放線菌數量最多。

從圖3可以看出，不同施肥處理下大豆根際真菌數量差異顯著，由大到小順序為O>F>OF>CK;其中，O處理下大豆根際真菌數量最多，顯著高于其他處理，說明施肥可以增加工礦復墾區大豆根際微生物真菌數量，且與CK相比，單施有機肥處理的真菌增量最大，而OF處理下增量最小。

2.2不同施肥處理下工礦復墾區大豆根際土壤平均顏色變化率動態變化

從圖4可以看出，大豆苗期根際土壤平均顏色變化率（average well color development，簡稱AWCD）吸光度隨培養時間的延長而增長，96 h后增長緩慢變化。在0～24 h內，大豆根際土壤AWCD吸光度基本上無明顯變化;在24～48 h內，大豆根際土壤吸光度迅速增加，其中，F處理下大豆根際土壤AWCD值最大;隨后在48～168 h時，大豆根際土壤AWCD吸光度的大小順序均為OF>F>O>CK;說明大豆根際土壤微生物活性影響對施肥的響應較強，施肥可以增加苗期大豆根際土壤碳的吸收率，且有機無機配施下大豆根際微生物活性最大，利用碳源的能力最強。

2.3工礦復墾區大豆根際微生物多樣性指數對施肥制度的響應特征

土壤微生物群落功能多樣性表征土壤生態系統中微生物群落對土壤中碳源類型利用多少的能力，本試驗采用的微生物多樣性指數為土壤微生物群落的香農-維納指數（H'）和Mclntosh均一度指數（U）[18]，計算公式見表1。

本試驗利用96 h的AWCD數據來分析計算工礦復墾區苗期大豆根際微生物多樣性指數，由表2可知，施肥對工礦復墾區大豆根際土壤微生物群落香農-維納指數、均一度指數有影響，CK處理下大豆根際微生物香農-維納指數和均一度指數最低，但是CK和F處理間差異均不顯著，而CK與OF處理差異均顯著（P<0.05），且OF處理下大豆根際微生物香農-維納指數最高。說明施肥處理有利于苗期大豆根際微生物香農-維納指數和均一度指數增加，使微生物活性提高，微生物代謝功能增強。總體來看，OF處理對于提高大豆苗期根際土壤碳源利用的效果較好。

2.4工礦復墾區大豆根際土壤微生物類別對施肥制度的響應特征

從圖5可以看出，不同施肥處理下工礦復墾區苗期大豆根際微生物豐度值大于5%的門有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍菌門（Cyanobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria），OF處理下放線菌門、藍菌門的豐度最低，變形菌門豐度最高，CK處理下綠彎菌門與酸桿菌門的豐度最高。

從圖6可以看出，工礦復墾區苗期大豆根際微生物屬對施肥制度的響應明顯。根據大豆根際微生物屬的相對豐度可以將其分為2類，CK與F具有相似親緣性，主要表現在豐度值較高的諾卡氏屬（Nocardoides）與土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）;O與OF具有相似親緣性，主要表現在豐度值較高的中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、糖霉菌屬（Glycomyces）、Ohtaekwangia和壤霉菌屬（Agromyces）。

3結論與討論

大豆根際土壤微生物數量對施肥制度響應明顯。本試驗發現，不同施肥處理下工礦復墾區苗期大豆根際細菌、放線菌、真菌數量均存在顯著性差異;其中，施肥處理的大豆根際微生物數量均顯著高于CK處理，且有機無機配施（OF）處理下大豆根際細菌、放線菌數量與CK處理相比數量差異最大。這與蘆思佳等的研究結果[19-21]一致。

施肥可以增加土壤有機質的含量，為微生物提供碳源與能量，進而提高土壤微生物活性，促進土壤微生物功能代謝[20]。本試驗發現，工礦復墾區苗期大豆根際土壤微生物AWCD隨時間的推移呈動態增加，有機無機配施處理下AWCD和微生物多樣性香農-維納指數最高，而CK處理下大豆根際微生物的AWCD與香農-維納指數最低，說明大豆根際微生物對有機無機配施處理響應強烈，原因可能是有機無機配施可以為根際微生物提供充足的碳源，提高微生物新陳代謝功能，因此對于改善山西工礦復墾區土壤微生物活性差、有機質含量低的特征效果最佳。

工礦復墾區苗期大豆根際微生物優勢屬在施肥處理間存在差異，且有機肥、有機無機配施下土壤微生物屬具有相似親緣性，而無機肥、對照處理下微生物屬具有相似親緣性。

土壤微生物是土壤生態系統變化的敏感性指標，可以表征土壤生態系統的質量和健康狀況[22-23]。傳統微生物培養適用于測定具有特殊生理功能的微生物，但當微生物種類較多時，無法培養，難以測定[24]。Biolog法可獲取微生物群落總體活性與代謝功能信息[25]，16S rDNA通過提取微生物組總DNA可鑒定微生物菌群結構[26]。本試驗利用傳統與現代微生物研究方法的優勢特點對工礦復墾區苗期大豆根際土壤微生物多樣性進行了研究，試驗結果得出，有機無機配施下大豆對改善土壤微生物活性效果最佳，并發現了其中豐度較高的優勢屬，但是大豆根系分泌物可能會因氣溫、降水等環境改變而變化，不同施肥處理下大豆根際微生物的優勢屬在快速生長期與衰退期可能會發生差異，因此有待后續進一步研究。

參考文獻：

[1]楊海君，肖啟明，劉安元. 土壤微生物多樣性及其作用研究進展[J]. 南華大學學報（自然科學版），2005，19（4）：21-31.

[2]Mondal K K，Dureja P，Verma J P. Management of Xanthomonas camprestris pv. malvacearum -induced blight of cotton through phenolics of cotton rhizobacterium[J]. Current Microbiology，2001，43（5）：336-339.

[3]Prosser J I. Molecular and functional diversity in soil micro-organisms[J]. Plant and Soil，2002，244（1/2）：9-17.

[4]Lynch J M，Whipps J M. Substrate flow in the rhizosphere[J]. Plant and Soil，1990，129（1）：1-10.

[5]王莉，張和生. 國內外礦區土地復墾研究進展[J]. 水土保持研究，2013，20（1）：294-300.

[6]劉勝洪，周玲艷，楊妙賢，等. 十種耐逆植物在和平縣稀土礦區生態修復中的應用[J]. 天津農業科學，2013，19（7）：92-96.

[7]王尚義，石琪，牛俊杰，等. 煤矸石山不同植被恢復模式對土壤養分的影響——以山西省河東礦區1號煤矸石山為例[J]. 地理學報，2013，68（3）：372-379.

[8]安韶山，李國輝，陳利頂. 寧南山區典型植物根際與非根際土壤微生物功能多樣性[J]. 生態學報，2011，31（18）：5225-5234.

[9]Adriaensen K，van der Lelie D，Van Laere A，et al.A zinc-adapted fungus protects pines from zinc stress[J]. The New Phytologist，2004，161（2）：549-555.

[10]孟令軍，耿增超，殷金巖，等. 秦嶺太白山區6種中草藥根際與非根際土壤化學性質及酶活性[J]. 應用生態學報，2012，23（10）：2685-2692.

[11]滕應，黃昌勇，龍健，等. 復墾紅壤中牧草根際微生物群落功能多樣性[J]. 中國環境科學，2003，23（3）：295-299.

[12]湛方棟，何永美，李元，等. 云南會澤廢棄鉛鋅礦區和非礦區三種野生植物根際微生物研究[J]. 土壤通報，2010，41（2）：337-342.

[13]方改霞. 礦區與非礦區艾蒿根部微生物數量比較研究[J]. 廣東農業科學，2009（5）：155-158.

[14]王義，李少朋，陳鑄，等. 叢枝菌根真菌對采煤塌陷地玉米生長的影響[J]. 安徽農業科學，2013，41（30）：12113-12115.

[15]楊期和，劉惠娜，李清華，等. 粵東鉛鋅尾礦區3種優勢植物根際土壤微生物的活性研究[J]. 中國農學通報，2012，28（30）：56-64.

[16]侯穎. 采煤塌陷復墾初期土壤微生物及根際效應研究[J]. 廣東農業科學，2013（15）：72-76.

[17]Riley D，Barber S A.Bicarbonate accumulation and pH changes at the soybean[Glycine max （L.）Merr.]root-soil interface[J]. Soil Science Society of America Journal，1969，33（6）：905-908.

[18]時鵬，高強，王淑平，等. 玉米連作及其施肥對土壤生物群落功能多樣性的影[J]. 生態學報，2010，30（22）：6173-6182.[HJ1.75mm]

[19]蘆思佳，韓曉增，張迪，等. 長期施肥對大豆根際微生物量碳、氮的影響[J]. 大豆科學，2009，28（3）：496-498.

[20]孟慶英，于忠和，賈繪彬，等. 不同施肥處理對大豆根際土壤微生物及土壤肥力影響[J]. 大豆科學，2011，30（3）：471-474.

[21]谷巖，吳春勝，王振民，等. 不同施肥處理對大豆根際土壤微生物和酶活性的影響[J]. 大豆科學，2010，29（6）：1008-1012.

[22]黎寧，李華興，朱鳳嬌，等. 菜園土壤微生物生態特征與土壤理化性質的關系[J]. 應用生態學報，2006，17（2）：285-290.

[23]王麗娟，李剛，趙建寧，等. 轉基因大豆對根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 農業環境科學學報，2013，32（2）：290-298.

[24]蔡燕飛，廖宗文. 土壤微生物生態學研究方法進展[J]. 土壤與環境，2002，11（2）：167-171.

[25]Zelles，Bai Q Y，Beck T，et al. Signature fatty acids in phospholipids and lipopoly saccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils[J]. Soil Biology and Biochemistry，1992，24（4）：317-323.

[26]劉國華，葉正芳，吳為中. 土壤微生物群落多樣性解析法：從培養到非培養[J]. 生態學報，2012，32（14）：4421-4433.