高效固氮菌Ecl分子鑒定及其在鐵尾礦基質下接種效果研究

劉歌暢　王留成　姚旭　張靜　李玉靈　徐學華

摘要：以高效固氮菌屬Ecl為研究對象，通過對Ecl進行分子鑒定及其在鐵尾礦基質下紫花苜蓿上進行接種試驗，對植株生長指標、土壤化學性質及土壤酶活性進行測定。結果表明，Ecl屬于固氮菌屬，16S rDNA PCR擴增產物片段大小為1 600 bp左右，其菌株可以促進紫花苜蓿植株的生長，提高土壤酶活性、土壤養分。被接種的紫花苜蓿植株生長狀況均優于未接種的處理，其地下干質量、地上干質量、株高、側根數、最長側根長度、主根長度比未接種的植株分別增加91.02%、83.43%、74.08%、56.70%、46.77%、48.54%，表明接種高效固氮菌Ecl可以促進植株的生長。紫花苜蓿接種Ec1，其土壤酶活性與土壤養分均高于對照。接種Ecl的植株比未接種植株的蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性分別增加 0.03 mg/（g·d）、3.95 μg/（g·h）、1.50 μg/（g·h）;速效磷、速效鉀、堿解氮含量分別增加57.83%、13.22%、29.48%。

關鍵詞：高效固氮菌Ecl;分子鑒定;盆栽;鐵尾礦;接種效果

中圖分類號： X171.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0279-05

鐵礦資源的快速發展使鐵尾礦排放量急劇增加[1]，而由于其綜合利用效率低，堆放面積大，易造成周邊環境污染[2]，因此必須進行鐵尾礦修復。鐵尾礦是缺乏土壤元素、生物難以生存的立地類型之一[3]，鐵尾礦的修復治理是目前人類急需解決的難題。

近年來，鐵尾礦修復研究成為熱點，植物生態恢復是鐵尾礦修復的重要途徑。馬云波等通過對人工與自然植被恢復下尾礦土壤微生物及酶活性時空變化的研究，表明人工林的土壤微生物數量種類及酶活性均顯著高于自然恢復模式[4];可見，植物恢復可明顯改善礦區生物學特性。王艷超等通過不同恢復模式對鐵尾礦和酶活性影響的研究，表明人工林下的酶活性顯著高于自然恢復，植被恢復可以有效縮短鐵尾礦修復的年限[5]。土壤微生物是土壤形成過程最活躍的生物成分，能促進土壤結構的形成和養分的循環，所以土壤微生物在鐵尾礦修復中占重要地位。王艷超在不同植被恢復模式下對鐵尾礦物種多樣性、土壤養分及生物因子進行研究，結果表明土壤微生物在鐵尾礦治理過程中有不可替代的作用[6]。閻愛華等通過對不同自然定居植被對鐵尾礦微生物數量、酶活性和生物多樣性影響的研究，表明土壤微生物在鐵尾礦修復起到關鍵作用[7]。由此可見，植被恢復和土壤微生物對于鐵尾礦修復都具有重要作用，利用植物與土壤微生物的協同作用來進行鐵尾礦修復非常具研究價值。

很多礦區選擇對鐵尾礦進行植被恢復，忽略土壤微生物的作用。目前，利用植物與微生物協同作用對鐵尾礦進行修復的研究較少。因此，本試驗利用李雯等篩選出的高效固氮菌Ecl[8]為基礎，進一步進行分子鑒定，并將其在鐵尾礦基質下接種于紫花苜蓿上進行盆栽試驗，探究接種高效固氮菌對植株生長、土壤酶活性以及土壤養分的作用規律，同時植物與微生物協同作用能為尾礦改善提供理論指導，為鐵尾礦廢棄地的生態治理提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料和試驗設計

試驗材料為紫花苜蓿（Medicago sativa L.）種子，由河北農業大學林學院提供。試驗設置5個處理：CK為空白對照，處理A為未滅菌未接菌，處理B為未滅菌接菌，處理C為滅菌未接菌，處理D為滅菌接菌。盆栽試驗在河北農業大學溫室中進行。于2016年8月將花盆裝滿土，土壤基質為尾礦砂和土壤按質量比1 ∶1混合，（滅菌尾礦砂+滅菌土壤、未滅菌尾礦砂+未滅菌土壤）。用水浸透花盆，挑選出顆粒飽滿、健康的紫花苜蓿種子，用55 ℃溫水浸泡種子約30 min，于陽光下暴曬，裁剪濾紙，用蒸餾水浸濕濾紙，將浸濕的濾紙平鋪在培養皿中，晚上將種子置于培養皿中，維持種子濕度。待培養的大部分種子開始膨脹時，將種子與含1%的羧甲基纖維素鈉的菌懸液按1 g ∶10 mL混合拌種，至混合均勻。將接種菌和未接種菌的種子埋入各處理土壤深度為2 cm處，每個處理15盆。試驗期間，進行正常澆水除草，保證植株正常生長。于2016年11月，隨機挑選各個處理的3個植株測定其生物量：首先，分別稱量植株地上部分和地下部分的鮮質量;然后，裝入信封袋，放于烘箱（已預熱）內，于100～105 ℃下殺青 10 min，待溫度降至70～80 ℃時，烘干至恒質量，取出、冷卻至室溫并稱干質量。同時，對植株株高、側根數、最長側根長等指標進行測量并記錄數據。

1.2試驗方法

1.2.1Ecl的分子鑒定

1.2.1.1Ecl系統進化分析在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）進行BLAST同源查找，獲得與Ecl同源的菌株，然后利用MEGA 5.0軟件進行的多序列比對，構建系統發育樹。

1.2.1.216S rDNA PCR擴增首先將細胞裂解液作為鑒定固氮菌屬的PCR模板。取1個1.5 mL艾本德（Eppendorf）管，依次加入200 μL無菌水、一環新鮮的單菌落和0.5～1.0 mm 玻璃珠，混勻振蕩3 min，沸水浴下放置10 min，冰浴下冷卻30 min。隨后，在預冷的離心機中，于4 ℃、11 000 r/min 下，離心1 min，吸取上清液，作為固氮菌屬的PCR模板。采用片段大小為1 500 bp左右的16S rDNA通用引物（上海生物工程有限公司），正向引物為27f：5′-GAGATTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。采用表1、表2的體系和條件進行擴增克隆，循環數為35個（重復步驟2～4）。

重復表1、表2的PCR熱循環擴增過程。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。取其4 μL PCR擴增產物和1 μL上樣緩沖液（loading buffer）混合均勻后點樣，設置電壓110 V、電泳20 min，在凝膠成像分析儀系統下觀察結果并保存。

1.2.1.3PCR回收產物與T載體連接

PCR回收產物與T載體連接操作遵從試劑盒的操作進行。在1.0 mL的離心管內，依次加入1.5 μL酶溶液（solution），4.5 μL回收產物，0.5 μL pMD18-T Vector（高效克隆PCR產物的專用載體），然后在37 ℃培養箱中連接。

1.2.1.4轉化吸取連接產物10 μL于1.0 mL的離心管內，依次加入試劑A 20 μL、無菌水70 μL、大腸桿菌40 μL，冷凍30 min，室溫放置20 min，加入LB液體培養基400 μL，于37 ℃培養箱內培養45 min，再在已預冷的離心機中于 7 000 r/min、4 ℃下離心2 min，去掉上清液。用槍頭吹吸剩余沉淀使其均勻分布。均勻涂抹在LB培養基上，于37 ℃培養箱放置16～18 h，把單菌落挑取至含有Amp+的LB液體培養基。

1.2.1.5質粒提取按照提取質粒試劑盒的操作進行。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。

1.2.2土壤化學性質和酶活性的測定

用0.5 mol/L NaHCO3法、1 mol/L NH4OAc浸提法、堿解擴散法分別測定土壤速效磷、速效鉀、堿解氮含量。用苯酸鈉比色法、3，5-二硝基水楊酸比色法、磷酸苯二鈉比色法分別測定脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶活性。

1.3數據處理

所收集的數據用Excel 2016/SPSS 23.0軟件統計處理，用ANOVA、Duncan s新復極差法方法進行單因素方差分析與顯著性檢驗（α=0.05），數據均以“平均值±標準誤”表示。

2結果與分析

2.1Ecl分子鑒定結果

16S rDNA PCR擴增產物如圖1所示，片段大小約為 1 600 bp。在NCBI網站利用BLAST工具查找與Ec1同源性高的菌株，采用MEGA 6.06軟件進行多序列比對并構建系統發育樹（圖2）。可知，與Ec1同源性較高的菌株有15株，其同源性均在98%以上，同源性最高為98.74%，菌株是Azotobacter tropicalis strain。細菌分類學家認定為當16S rDNA序列的同源性高于97%時，可斷定是屬內同種;同源性低于95%時，則斷定為屬外種。由此可斷定Ec1屬于自生固氮菌，加上16S rDNA序列鑒定以及擴增產物，可以斷定Ec1為固氮菌屬（Azotobacter）。這與Biolog的鑒定結果一致。

2.2Ecl對紫花苜蓿生長的影響

由表2可知，植株地上干質量、地下干質量、株高、側根數、最長側根長度、主根長度平均值的大小順序均為處理D>處理B>處理C>處理A;滅菌后接種Ecl植株地上干質量比未接種的植株高83.43%;處理D、處理B與處理C、處理A的植株地上干質量存在顯著性差異，說明無論土壤是否滅菌，加入Ecl對植株的地上干質量均有顯著影響。

滅菌后接種Ecl植株地下干質量比未接種的植株高 91.02%。處理D、處理B與處理C、處理A的植株地下干質量存在顯著性差異，說明無論土壤是否滅菌，加入Ecl對植株的地下干重均有顯著影響。

滅菌后接種Ecl植株的株高比未接種的植株高74.08%。處理D的植株株高最高，且顯著高于與其他處理;處理B次之，其株高顯著高于未接種的處理C和A;說明無論土壤是否滅菌，加入Ecl對植株株高均有顯著影響。

滅菌后接種Ecl植株的側根數比未接種的植株多 56.70%。處理D、處理B與處理C、處理A植株側根數存在顯著性差異，說明無論土壤是否滅菌，加入Ecl對植株側根數均有顯著影響。

滅菌后接種Ecl植株的最長側根長度比未接種的植株長，長46.77%。處理D、處理B與處理C、處理A植株側根數存在顯著性差異，說明無論土壤是否滅菌，加入Ecl對植株最長側根長度均有顯著影響。

滅菌后接種Ecl植株的主根長度比未接種的植株長，長48.54%。處理D、處理B與處理C、處理A植株側根數存在顯著性差異，說明無論土壤是否滅菌，加入Ecl對植株主根長度均有顯著影響。

綜上所述，接種高效固氮菌Ecl能夠顯著促進植株地下干質量、地上干質量、株高、側根數、最長側根長度、主根長度的增加，說明接種高效固氮菌促進了植株的生長發育。韓志順等通過接種不同根瘤菌對紫花苜蓿固氮效能及生物量影響的研究表明，接種根瘤菌后，土壤中可供植株吸收的營養元素含量提高，植株生長得到促進，即菌株對干草增產效果明顯[9]。員子晶等通過油松幼苗菌根優良磷鉀細菌的篩選及對油松促生作用的研究表明，接種后土壤中酶活性提高，微生物運動活躍，有利于油松吸收營養，促進植株的伸長，即接種處理可以促進油松的生長[10]，可見該菌對油松有促生效果。本試驗中，促進植株生長的原因可能是接種高效固氮菌后土壤養分含量增高，進而使得土壤微生物代謝活躍，供植物所需的營養元素含量增加，植株的生長代謝得到促進。

2.3Ecl對土壤化學性質的影響

2.3.1對土壤堿解氮的影響

由圖3可知，處理D（植株接菌）與處理C（植物未接菌）的土壤堿解氮含量分別為25.21、19.47 mg/kg，即接種植株比未接種植株的土壤堿解氮含量高29.48%。處理D、處理B的土壤堿解氮含量顯著高于與其他處理，處理A、處理C顯著高于CK。可知，土壤是否滅菌對土壤堿解氮含量無顯著性影響。

2.3.2對土壤速效磷的影響

由圖4可知，處理D與處理C的土壤速效磷含量分別為18.34、11.62 mg/kg，即接種植株比未接種植株的土壤速效磷含量增加57.83%。處理D、處理B的土壤速效磷含量顯著高于與其他處理，處理A、處理C與CK的土壤速效磷含量差異不顯著。說明土壤是否滅菌對土壤中速效磷含量無顯著性影響。

2.3.3對土壤速效鉀的影響

由圖5可知，處理D與處理C的土壤速效鉀含量分別為56.42、49.83 mg/kg，即接種植株比

未接種植株的土壤速效鉀含量增加13.22%。處理D、處理B的土壤速效磷含量顯著高于與其他處理，處理A、處理C與CK的土壤速效磷含量差異不顯著。說明土壤是否滅菌對土壤中速效鉀含量無顯著性影響。

綜上所述，接種高效固氮菌可以提高土壤養分含量。接種高效固氮菌后，土壤微生物運動活躍，土壤養分含量提高，本試驗結果與葉少萍的研究結果[11]一致。

2.4Ecl對土壤酶活性的影響

土壤酶是一種具有特殊催化能力的蛋白質[12]。土壤內的任何化學反應都是在酶的參與下完成的，土壤酶活性可以體現土壤中所有生化反應進行的方向與強度，是土壤的屬性之一[13]。

2.4.1對土壤蔗糖酶的影響

由圖6可知，處理D與處理C的土壤蔗糖酶活性分別為0.082、0.052 mg/（g·d），即接種植株比未接種植株的土壤蔗糖酶活性提高0.03 mg/（g·d）。CK與其他處理差異顯著，雖然處理A與處理B、處理D差異不顯著，但處理B、處理D的蔗糖酶含量明顯高于處理A，且處理B、處理D差異不顯著，表明無論土壤是否滅菌，接種Ecl均可明顯提高土壤蔗糖酶活性。處理A與處理C之間無顯著差異性，說明土壤滅菌對蔗糖酶含量無顯著性影響。

2.4.2對土壤脲酶的影響

由圖7可知，處理D與處理C的土壤脲酶活性分別為7.35、3.40 μg/（g·h），即接種植株比未接種植株的土壤脲酶活性提高3.95 μg/（g·h）。處理B、處理D的土壤脲酶活性與其他處理均有顯著性差異，表明無論土壤是否滅菌，接種Ecl均可顯著提高土壤脲酶活性。處理A與處理C之間無差異，說明土壤是否滅菌對脲酶含量無顯著性影響。

2.4.3對土壤磷酸酶的影響

由圖8可知，處理D與處理C的土壤磷酸酶活性分別為10.98、9.48 μg/（g·h），即接種植株比未接種植株的土壤磷酸酶活性提高1.50 μg/（g·h）。CK的土壤磷酸酶活性均顯著低于其他處理;處理C與處理B、處理D差異顯著;處理A與處理D差異顯著，與處理B差異不顯著;但處理B、處理D的土壤磷酸酶活性明顯高于處理A、處理C。說明無論土壤是否滅菌，接種Ecl均可明顯提高土壤堿性磷酸酶活性。

接種高效固氮菌后，土壤微生物數量增加，土壤酶活性增強。一些研究表明，土壤微生物的種類和數量能在一定程度上反映土壤酶的活性，土壤微生物數量多，土壤酶活性高，土壤有效養分供給充足[14-15]。初佳芮研究了鏈霉菌769對大豆生長過程疫霉根腐病抗性及土壤微環境的影響，表明施用鏈霉菌769能提高土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶等生物酶的活性，說明該菌可改善土壤微環境[16]。本試驗結果與之相符。

2.5接菌植株生長、土壤化學性質與酶活性的相關性

由表5可知，接菌后的植株各生長指標之間均呈極顯著正相關關系。植株生長指標與土壤養分含量之間呈正相關關系，其中堿解氮含量與地下干質量、側根數呈顯著正相關;速效磷與生長的各指標呈顯著正相關;速效鉀含量與地上干質量、地下干質量、最長側根數呈顯著正相關，與株高和主根長度呈極顯著正相關。植株生長指標與土壤酶活性呈顯著或極顯著正相關，其中磷酸酶活性與各指標均呈極顯著正相關;脲酶活性與株高、最長側根數呈極顯著正相關;蔗糖酶活性與最長側根數、主根長度呈極顯著正相關。磷酸酶活性與土壤速效鉀質量、速效磷質量呈極顯著正相關，土壤有機磷轉化是多個因子共同作用的結果，磷酸酶參與轉化過程可加速進程。土壤磷酸酶活性是評價磷素生物轉化方向強度的指標之一。脲酶活性與土壤堿解氮含量呈極顯著正相關，土壤脲酶屬于水解酶，與氮素的轉化過程有關。蔗糖酶活性與土壤速效磷呈極顯著正相關。

3討論與結論

本試驗從鐵尾礦中篩選1株Ecl并進行16S rDNA序列對比分析，結果表明，Ecl與Azotobacter tropicalis strain的同源性為98.74%，初步斷定其為固氮菌屬。

盆栽接種試驗表明，與未接菌的處理相比，接種Ecl的紫花苜蓿植株地上干質量、地下干質量、株高、側根數、最長側根長度、主根長度均顯著增加，可見接種高效固氮菌Ecl可以促進植株生長。其原因可能有以下幾點：第一，植株接種菌株后，能有效地將土壤基質中的無效磷和氮轉化成植株生長所需的必要元素P、N[17-18];第二，菌株可分泌細胞分裂素（CTK）、生長素等植物激素，這些激素通過影響植物代謝、呼吸機制，刺激植物根系生長發育，吸收營養物質來促進植株生長[19-20];第三，菌株可促進植物根系分泌質子，提高植物對礦質元素Fe的吸收，以此促進植物的生長[21-22];第四，菌株可以調節根系內酶活性、ATP等指標，增加植株活性，提高植株的增長[23];第五，菌株可改善盆栽基質微生態環境，接種菌后可定殖在植株根際，抑制有害微生物的入侵，保護植物免受其干擾[24-26]。以上5種Ecl哪個起到主導作用，有待進一步研究。

由土壤化學性質和酶活性的試驗可知，與未接種的處理相比，接種高效固氮菌Ecl，土壤脲酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶含量均明顯增加，說明高效固氮菌對土壤活化有積極作用，該菌可在短時間內活化土壤，改善鐵尾礦，因此，高效固氮菌Ecl對于鐵尾礦的改良具有重要的意義。接種高效固氮菌Ecl，土壤堿解氮、速效磷、速效鉀含量顯著增加，土壤養分提高，可見接種高效固氮菌可有效改善鐵尾礦基質中土壤的化學性質。此外，與直接施用化肥相比，接種高效固氮菌Ecl有對生態環境無污染、低消耗、低成本等特點，且該菌株能快速適應鐵尾礦這種惡劣的環境。綜上所述，利用植物與土壤微生物協同作用來進行鐵尾礦修復的研究具有巨大的應用前景，引入微生物可以改善生態退化區的土壤基質，有助于科學有效地改良尾礦沙微生態環境，營造鐵尾礦區人工林，，為鐵尾礦廢棄地的改良提供科學的理論指導。

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