Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路參與氨致星形膠質細胞水腫

賈桂枝 王蕊 岳怡 戴紅良

(錦州醫科大學 1生理學教研室，遼寧 錦州 121001；2第一臨床學院2016級本科；3護理學院)

肝性腦病是引起肝病患者死亡的重要原因。通過尸體解剖與動物實驗發現肝性腦病中發生的腦水腫、顱內高壓及腦疝是導致死亡的病理基礎〔1〕。人體磁共振成像研究顯示肝性腦病腦水腫屬細胞性水腫，即星形膠質細胞水腫〔2〕。研究證實在嚴重肝病時，機體不能對氨進行有效清除，導致患者腦組織氨濃度過度升高，從而引起星形膠質細胞水腫及肝性腦病的發生〔3,4〕。Ca2+是細胞內重要的第二信使分子，之前有研究發現，氨刺激星形膠質細胞后可導致細胞內Ca2+瞬時增加，進而引起星形膠質細胞水腫〔5〕。Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路是細胞內介導各種生理、病理效應的重要信號通路〔4〕。本文旨在探討該通路是否介導氨引起的星形膠質細胞水腫，為進一步理解肝性腦病的發病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 DMEM培養基購自美國康寧公司；馬血清購自Gibco公司；dBcAMP購自美國Sigma公司；Calcein/AM熒光探針購自美國Invitrogen公司；表皮生長因子受體(EGFR)抗體購自美國Cell Signaling公司；細胞外調節蛋白激酶(ERK)及磷酸化(p)-ERK購自美國Santa Cruz公司；磷脂酶(PL)C抗體購自美國Abcam公司。

1.2 原代星形膠質細胞培養及分組 取出生24 h內的CD-1小鼠大腦皮層，在顯微鏡下剝離腦膜及血管后，將腦組織切碎，加入含20%馬血清的DMEM培養液中，旋渦震蕩1 min。將組織懸液先后用孔徑為80 μm和10 μm的濾膜過濾。將所得到的細胞懸液接種到鋪有蓋玻片的24孔培養板或60 mm培養皿中，培養液為含7.5 mmol/L葡萄糖的 DMEM培養基，最初加20%馬血清，置于37℃，5% CO2培養箱中培養。每周換液2次，第1周為含20%馬血清的DMEM培養液，第2周為10%馬血清的DMEM培養液，第3周在培養液中加0.25 mmol/L dBcAMP促進細胞分化成熟。將培養成熟的星形膠質細胞分為對照組、氧化銨組、U73122+氯化銨組、BAPTA+氯化銨組、BGF 109203X+氯化銨組、AG1478+氯化銨組。

1.3 熒光探針技術測定細胞體積 將蓋玻片上培養成熟的星形膠質細胞以5 μmol/L Calcein 37℃避光孵育30 min，然后吸棄熒光染料，再用等滲液洗滌細胞2次，以除去細胞外未負載的熒光探針。最后，將細胞置于活細胞熒光顯微鏡載物臺上，檢測細胞內Calcein熒光強度(激發波長和發射波長分別為490和535 nm)，以間接反映細胞體積水平。

1.4 免疫凝膠電泳及免疫印跡分析 將含有0.1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液加入培養皿中以獲得全細胞裂解物并利用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法進行蛋白定量。將等量蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并電轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜依次經5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃過夜孵育和二抗室溫2 h孵育后，利用增強化學發光法顯色。利用ImageJ 1.42軟件對條帶灰度進行分析，從而半定量確定各組蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫共沉淀 用免疫共沉淀裂解液收集樣品并勻漿。將1 mg蛋白與特異性一抗于4℃、垂直旋轉狀態下過夜孵育。次日，將protein G加入上述體系繼續孵育2 h。隨后，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，將獲得的免疫沉淀物與上樣緩沖液混合，100℃變性5 min后，13 000 r/min離心5 s取上清，后續用于SDS-PAGE電泳及蛋白質免疫印跡分析。

1.6 細胞內Ca2+瞬變檢測 將5 μmol/L Fura-2 Ca2+熒光探針與蓋玻片上培養成熟的星形膠質細胞共同避光孵育30 min，充分去除細胞外未負載的熒光探針后，在340和380 nm激發波長，510 nm發射波長下，檢測細胞內Ca2+水平。

1.7 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1 U73122、BAPTA、GF109203X抑制氨誘導的星形膠質細胞水腫 與對照組(1.00±0.04)相比，氯化銨組(1.48±0.17)星形膠質細胞相對體積明顯增加(P<0.05)；與氯化銨組比較，U73122+氯化銨組、BAPTA+氯化銨組、GF109203X+氯化銨組(0.98±0.09、1.02±0.14、0.99±0.10)顯著降低(P<0.05)。

2.2 U73122及AG1478抑制氨誘導的細胞內Ca2+瞬時增加 與對照組比較，氯化銨組細胞內Ca2+(340/380峰值：0.66±0.07)瞬時增加，而U73122+氯化銨組及AG1478+氯化銨組(0.41±0.07、0.41±0.03)顯著低于氯化銨組(均P<0.05)，見圖1。

圖1 各抑制劑對星形膠質細胞內Ca2+水平的影響

2.3 氨刺激增加PLC與EGFR的結合 與對照組(1.00±0.11)相比，氯化銨組EGFR/PLC(1.82±0.26)顯著增加(P<0.05)，見圖2。

2.4 GF109203X抑制氨誘導的ERK磷酸化 與對照組(1.00±0.12)相比，氨刺激顯著增強ERK的磷酸化(1.87±0.16，P<0.05)。與氯化銨組相比，GF109203X組和GF109203X+氯化銨組(0.98±0.05、1.00±0.12)顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖2 氨對星形膠質細胞EGFR/PLC結合的影響

圖3 GF109203X對星形膠質細胞ERK磷酸化的影響

3 討 論

EGFR屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族。該家族包含4個密切相關的成員，即ErbB1/EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4。在靜息狀態下，EGFR以非活化的形式表達于胞質膜。當受到體內外環境中各種因素的刺激后，某些激酶和(或)其特異性配體(該配體往往源于對跨膜前體的蛋白水解釋放)可誘導EGFR的間接激活。激活后的EGFR導致同源或異源二聚體的形成，進而刺激其內源性酪氨酸激酶活性，導致其胞質結構域內特定酪氨酸殘基的磷酸化，最終導致下游信號級聯的激活〔5〕。因為EGFR在腫瘤發生發展中起重要作用，故目前對EGFR的研究主要集中于腫瘤領域〔6〕。前期研究顯示EGFR間接激活介導的絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號級聯在氨誘導星形膠質細胞過程中也起到了至關重要的作用〔7,8〕。除MEK/ERK和PI3K/AKT信號級聯外，Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路也是傳遞EGFR活化信號的重要機制〔9〕。細胞內Ca2+水平的增加是氨引起星形膠質細胞水腫的重要機制之一。Ca2+誘導水腫的機制與其激活Ca2+依賴性的、促進活性氧氮簇(RONS)生成的酶類有關。這些酶包括還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NADPH)、組成型一氧化氮合酶、磷脂酶A2等〔3〕。本研究發現，Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路各關鍵分子的抑制劑U73122(針對PLC)、BAPTA(針對Ca2+)、GF109203X(針對PKC)均可顯著抑制氨誘導的星形膠質細胞水腫，同時，氨誘導的細胞內Ca2+升高可被U73122所抑制，表明該通路的激活參與了氨誘導星形膠質細胞水腫的過程。

此外，本文還表明在高氨毒性狀態下，Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路的激活與EGFR間接激活有關。本研究結果顯示，氨刺激可增加EGFR免疫沉淀物中PLC的水平，表明氨的確有可能促進EGFR與PLC的相互作用。前期研究已顯示，高濃度氨可刺激各信號復合物Na/K-ATP酶α1、EGFR、Src、ERK、AKT在星形膠質細胞胞質膜內陷形成的細頸瓶狀特殊膜結構小窩(caveolae)中的集裝，進而導致相關分子的活化〔7〕。本研究進一步證實，PLC也可能通過加入上述信號復合物介導下游分子的激活。

研究顯示，在β腎上腺素受體誘導心肌細胞肥大〔10〕及P2X7受體介導神經前體細胞神經元分化〔11〕等過程中也存在PKC作為上游分子激活ERK的機制〔12，13〕。Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路可作為ERK的上游信號分子介導氨誘導細胞水腫的過程。