廣寄生對糖尿病小鼠肝臟的保護作用及機制

羅澤萍 潘立衛 李麗

(1河池學院化學與生物工程學院，廣西 河池 546300；2廣西中醫藥大學藥學院藥理教研室)

2型糖尿病(T2DM)是一組以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，最新的流行病學研究顯示我國大約11%的人口患有糖尿病，并呈逐年增長的趨勢〔1〕。糖尿病并發癥的發生率、致殘率和致死率極高，常可累及調節糖脂代謝的肝臟，導致肝損傷和功能障礙，甚至演變為肝硬化或肝癌〔2〕。因此，改善糖尿病引起的肝損傷及促進肝損傷的修復在治療糖尿病及減少并發癥的發生具有重要意義。中草藥對于慢性病的治療，具有西藥無法比擬的作用溫和持久、多靶點、副作用小及減少并發癥發生的優點而成為降血糖藥物研究的寶貴資源。廣寄生為桑寄生科，鈍果寄生屬植物。具有治療腰膝酸軟、風濕痹痛、胎漏、胎動及降血壓等功效〔3〕。現代藥理學研究發現桑寄生科植物具有抗腫瘤、降血脂、抗炎、鎮痛、抗氧化及加快消耗HepG2細胞葡萄糖等作用〔4～10〕，而有關桑寄生科植物降血糖作用的研究甚少，本研究旨在探討桑寄生科植物廣寄生對T2DM小鼠肝臟的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，廣西醫科大學動物實驗中心提供，合格證號SCXK(桂)2014-0002。

1.1.2 藥物 廣寄生采摘于廣西河池市宜州區郊外，經河池學院化學與生物工程學院鄧晰朝副教授鑒定為廣寄生(寄主為桑樹)的莖葉，藥物提取方法：廣寄生50℃烘干，粉碎成粗粉。取粗粉5 kg，依次用95%乙醇、60%乙醇滲漉提取，各收集10倍量(體積)滲漉液，滲漉液合并，減壓回收乙醇，得總提取物浸膏約614.3 g，4℃冰箱保存，備用。

1.1.3 主要儀器 XL-300全自動生化分析儀(德國歐霸ERBA公司)；xMark酶標儀(美國伯樂BIO-RAD公司)；DH-20F臺式高速冷凍離心機(長沙百諾克離心機儀器有限公司)；AUW220D分析天平(日本島津公司)；HH-S4數顯恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)。

1.1.4 主要試劑 葡萄糖測定試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，2017033)；谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，2017007)；谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，2017022)；總膽固醇(TC)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171218)；三酰甘油(TG)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171216)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma，S0130)；堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171221)；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171218)；白細胞介素(IL)-2、4、12酶聯免疫吸附試驗( ELISA)試劑盒、γ-干擾素ELISA試劑盒、B細胞淋巴瘤因子(Bcl)-2 ELISA試劑盒、Bcl-2相關X蛋白(BAX)ELISA試劑盒、血紅素氧合酶(HO)-1 ELISA試劑盒、Toll樣受體(TLR)-4 ELISA試劑盒、核因子(NF)E2相關因子(Nrf2)ELISA試劑盒、NF-κB亞基p65親和肽(NF-κBp65)ELISA試劑盒及過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)-α ELISA試劑盒(上海優選生物科技有限公司；201804)。

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠肝損傷模型制備 高糖高脂飼料喂養4 w后，連續7 d腹腔注射STZ 45 mg/(kg·d)。7 d后，檢測空腹血糖(FBG)≥12 mmol/L視為高血糖模型形成。T2DM繼續給予高糖高脂飼料喂養4 w后，檢測肝臟功能指標變化，與空白對照組相比，以ALT、AST及ALP活性明顯升高(P<0.05)，確定T2DM小鼠肝損傷模型建立。

1.2.2 分組及給藥 隨機把T2DM肝損傷小鼠分為5組，分別為陽性對照組〔二甲雙胍150 mg/(kg·d)+聯苯雙酯150 mg/(kg·d)〕、模型對照組(等體積生理鹽水)、廣寄生高劑量組〔36 g/(kg·d)〕、中劑量組〔18 g/(kg·d)〕及低劑量組〔9 g/(kg·d)〕各12只。另設空白對照組(等體積生理鹽水)小鼠12只。藥物或生理鹽水灌胃4 w末，摘眼球取血后，立即解剖取肝臟，用預冷的生理鹽水沖洗3次后置-80℃冰箱保存。

1.2.3 血清相關指標測定 按試劑盒說明書操作測定血清FBG、TC、TG、ALT、AST、ALP、SOD、MDA及T-AOC水平。

1.2.4 肝組織相關指標測定 按試劑盒說明書制備肝組織勻漿測定IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、Bcl-2、BAX、HO-1、TLR4、Nrf2、NF-κBp65及PPAR-α的含量。

1.2.5 肝細胞觀察 肝組織經過石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色之后在光學顯微鏡下觀察肝細胞形態結構變化。

1.3 數據分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 血糖、血脂測定結果 與空白對照組相比，模型對照組FBG、TC及TG均明顯升高(P<0.01)。陽性對照組、廣寄生高、中、低劑量組FBG、TC及TG均較模型對照組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 廣寄生對T2DM小鼠血糖、血脂的影響

與空白對照組比較：1)P<0.01；與模型對照組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 肝功能指標測定結果 與空白對照組相比，模型對照組ALT、AST及ALP均明顯升高(P<0.01)。陽性對照組、廣寄生高、中及低劑量組ALT、AST及ALP均明顯低于模型對照組(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 廣寄生對T2DM小鼠肝功能指標的影響

2.3 抗氧化能力的測定結果 與空白對照組相比，模型對照組MDA值明顯升高，而SOD和T-AOC活性明顯降低(P<0.01)。陽性對照組、廣寄生高、中及低劑量組MDA值較模型對照組明顯下降、SOD和T-AOC活性明顯升高(P<0.01，P<0.05)。見表3。

表3 廣寄生對T2DM小鼠抗氧化能力的影響

2.4 免疫指標測定結果 與空白對照組相比，模型對照組IL-2、IL-4值明顯降低，IL-12、IFN-γ值明顯升高(P<0.01)。陽性對照組、廣寄生組IL-2、IL-4值較模型對照組明顯升高，IL-12、IFN-γ明顯降低(P<0.01，P<0.05)。見表4。

表4 廣寄生對T2DM小鼠肝細胞因子的影響

2.5 肝細胞凋亡相關指標的測定結果 與空白對照組相比，模型對照組Bcl-2、HO-1、Nrf2、PPAR-α值顯著降低，Bax、TLR4、NF-κBp65顯著升高(均P<0.01)；與模型對照組比較，陽性對照組、廣寄生組Bcl-2、HO-1、Nrf2、PPAR-α值明顯升高，Bax、TLR4、NF-κBp65值明顯降低(P<0.01，P<0.05)。見表5。

表5 廣寄生對T2DM小鼠肝細胞凋亡相關指標的影響

2.6 小鼠肝細胞 HE 染色圖 空白對照組小鼠肝組織結構完整，肝細胞分界清晰，大小均勻，細胞核圓而清晰。模型對照組小鼠肝細胞結構異常，肝組織有大量空泡，細胞核固縮。陽性對照組和廣寄生高、中、低劑量組小鼠肝細胞結構紊亂明顯改善，不同程度的減輕糖尿病小鼠肝臟病理改變。見圖1。

圖1 各組肝細胞HE染色(×40)

3 討 論

長期高血糖應激導致體內的葡萄糖和脂肪酸不能被很好利用，致使多余的葡萄糖和脂肪酸在肝臟內轉變成脂肪，脂肪在肝內的沉積導致肝損傷，嚴重者可轉變為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，因此對糖尿病肝損傷的干預十分重要。機體血糖升高時，肝臟內脂質合成也增加，血清TC、TG增高均多見于糖尿病患者〔11〕。本研究表明廣寄生具有降血糖的作用，其降血糖作用可能與改善T2DM小鼠脂代謝紊亂有關。ALT、AST及ALP存在肝細胞內，當肝臟受到損傷或者出現功能障礙時，便釋放到血液中導致血清ALT、AST及ALP升高〔12〕。本研究結果說明廣寄生對T2DM造成的肝損傷有一定的保護作用。糖尿病患者內分泌紊亂會導致活性氧(ROS)代謝失調，體內過多的ROS是導致糖尿病并發癥和細胞損傷的重要因素〔13〕。本研究結果說明廣寄生能提高T2DM小鼠抗氧化能力從而在一定程度上減少T2DM并發癥的發生。細胞因子是T2DM發病的重要促進因子，INF-γ對胰島β細胞有直接的細胞毒性作用，而IL-4具有促進B細胞增殖和分化，對自身免疫性糖尿病有很強的保護作用〔14〕。IL-12水平升高可加重胰島素抵抗同時可直接影響β細胞增殖、分化和IFN-γ產生〔15〕，IL-2因促進B淋巴細胞的生長，刺激抗體合成而發揮重要的免疫調節作用〔16〕。糖尿病患者常因免疫功能低下而并發感染，因此，提高機體免疫功能，在減少并發癥的發生具有重要意義。本研究發現，廣寄生能降低T2DM小鼠肝細胞INF-γ、IL-12值，升高IL-2、IL-4水平，以提高免疫功能，對防治T2DM感染具有重要意義。細胞凋亡受到細胞內凋亡調節蛋白的調控，而凋亡蛋白又分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類。Bcl-2、Bax分別發揮抗凋亡和促凋亡作用，兩者的比值決定著細胞凋亡的發生〔17〕。本研究發現廣寄生具有增強T2DM小鼠的Bcl-2轉錄活性，同時降低Bax轉錄活性。HO-1通過抗炎、抗凋亡、抗老化及改善微循環而起到保護細胞內源性蛋白的作用〔18〕。本實驗發現廣寄生具有增強T2DM小鼠肝組織的HO-1活性作用，表明廣寄生的降糖保肝作用可能與增強肝組織HO-1活性有關。在高血糖狀態下，TLR4作為機體炎性反應鏈的啟動蛋白促使炎癥反應而導致使肝細胞受損、凋亡及功能障礙〔19〕。本實驗發現廣寄生能降低T2DM小鼠肝組織TLR4含量，從而降低糖尿病性肝炎或肝損傷的發生。持續的高血糖會誘發ROS產生，過多的ROS導致胰島素抵抗。Nrf2可以減少ROS的產生，減少由氧化應激介導的自噬性胰島β細胞凋亡從而改善由氧化應激誘導的胰島素抵抗〔20〕。本實驗發現廣寄生能升高T2DM小鼠肝組織Nrf2含量，說明廣寄生的保肝作用與增強Nrf2轉錄活性改善胰島素抵抗的作用有關。NF-κB與糖尿病患者胰島細胞的增殖和凋亡關系密切，p65蛋白作為NF-кB通路蛋白家族的重要組分能加速炎癥基因表達〔21〕。本實驗發現廣寄生能降低T2DM小鼠肝組織NF-κBp65的含量，表明廣寄生的保肝作用與降低炎癥基因表達的作用有關。PPAR-α在脂肪酸、脂蛋白代謝的過程具有調節脂代謝、糖代謝、改善胰島素抵抗的作用〔22〕。本研究發現廣寄生能升高T2DM小鼠肝組織PPAR-α含量，說明廣寄生的保肝作用與增強PPAR-α轉錄活性，改善糖尿病代謝紊亂的作用有關。