miR-8在腦膜瘤中的表達及抑制腦膜瘤細胞增殖的機制

何澤元 包堃旸 李倫 黃昌仁 幸文利

(遂寧市中心醫院神經外科，四川 遂寧 629000)

微小RNAs(miRNAs)是一類長度18～22 個核苷酸非編碼RNA〔1,2〕，通過與靶基因的3′UTR區互補結合，調控靶基因的表達〔3，4〕。研究證實miRNAs在多種腫瘤的發生發展中起重要作用〔5〕。腦膜瘤是常見的顱內腫瘤之一〔6〕，對miRNA在腦膜瘤中的表達及作用機制研究尚少，對腦膜瘤中miRNA表達及作用機制的研究，有助于明確腦膜瘤發病機制，指導治療。研究表明，miRNA(miR)-8能抑制多種腫瘤細胞增殖〔7〕，而其在腦膜瘤中的研究較少。本研究通過檢測腦膜瘤患者組織中miR-8的表達情況，初步探討miR-8的生物學功能及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性收集2016年1月至2017年1月遂寧市中心醫院神經外科接受手術的22 例腦膜瘤患者手術標本，男16 例，女6 例；平均年齡(58.6±11.7)歲，良性腦膜瘤(Ⅰ級) 9例，非典型性腦膜瘤(Ⅱ級)8例，惡性腦膜瘤(Ⅲ級)5例，患者均經術后病理學檢查證實為腦膜瘤，患者或家屬均知情同意。

1.2 實驗材料 人腦膜瘤細胞系IOMM-Lee購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，miR-8 mimics、miR-control(大連寶生物工程有限公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)，LipofectamineTM2000轉染試劑盒、逆轉錄試劑盒(美國Introvigen公司)，地高辛標記的anti-miR-8探針(EXIQON公司)。目的基因引物序列：miR-8：正義鏈5′-TAGCAAGTCGTAAGCTA-3′,反義鏈5′-GTTAGTAGGTCAATCGGGATAC-3′;miR-control：正義鏈5′-GACCTATCGGATAAGTC-3′,反義鏈5′-GTCAAATCGATCCGAT-3′;RAC1：正義鏈5′-GTAGCACGTAAGTCAGTCA-3′,反義鏈5′-GTCATAGCTGGGACATCCTAAC-3′;β-actin：正義鏈5′-GCTAGCTAACGTGAG-3′,反義鏈5′-GACCACGCTGCGCATGGA-3′。

1.3 原位雜交 腦膜瘤及瘤旁組織石蠟切片常規脫蠟后，采用地高辛標記的miR-8探針進行原位雜交，37℃雜交過夜，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，染色強度由同一位高年資病理科醫生判斷。

1.4 細胞培養與轉染 人腦膜瘤細胞系IOMM-Lee，10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，培養條件37℃、5% CO2恒溫箱；取對數生長期的IOMM-Lee細胞消化后以2×105/孔濃度接種至6孔板，按LipofectamineTM2000轉染試劑盒操作說明miR-8與轉染試劑加入6孔板，輕輕混勻，培養箱中孵育8 h(miR-8組)，熒光定量PCR檢測轉染后miR-8的表達，評估轉染效果，另取miR-control、生理鹽水作為陰性對照(miR-control)組和空白對照(NC)組，每組重復3次，收集各組轉染后細胞用于后續實驗。

1.5 miR-8對IOMM-Lee細胞增殖活性的影響 取轉染后的3組細胞，胰酶消化后，按2×105個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入10 μl噻唑藍(MTT)溶液，孵育4 h后，加入150 μl MTT溶液，酶標儀檢測490 nm處的OD值，計算細胞的增殖抑制率；另取3組單細胞懸液接種到6孔板中，培養箱中培養7 d，吉姆薩染色，顯微鏡下計數，計算克隆形成率。

1.6 miR-8的靶基因的預測與驗證 應用生物信息學技術，在TargetScan預測Ras相關的C3肉毒素底物(RAC)1可能是miR-8的靶基因，設計RAC1基因引物序列，并在兩端加上XbaⅠ和 NotⅠ內切酶剪切位點，RAC1 3′UTR 的上游引物序列：5′-ACGTTGAGGTAGTAGTCCGACA-3′，下游引物序列：5′-TCTATACGAGCGCTGACAG-3′，獲得重組載體pMD18-T-RAC1，將載體質粒分別與3組轉染細胞共培養48 h后，使用雙熒光素酶報告基因系統檢測細胞熒光素酶活性；另取3組細胞，熒光定量PCR檢測miR-8轉染后各組細胞內RAC1 mRNA的表達。

1.7 統計方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 miR-8在腦膜瘤組織中的表達 miR-8在腦膜瘤組織(85.6±23.7)中的表達顯著低于瘤旁組織(121.8±34.7，P<0.001)，DAB染色后可見棕色顆粒沉積(圖1)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級腦膜瘤中miR-8表達分別為：105.2±26.2、74.4±19.8、63.9±11.5，Ⅲ級腦膜

瘤中miR-8表達最低，差異有統計學意義(F=7.364，P=0.004 3)，表明miR-8可能與腦膜瘤的發生、發展有關。

圖1 miR-8在腦膜瘤組織中的表達(×200)

2.2 miR-8對IOMM-Lee細胞增殖活性的影響 miR-8組miR-8 mRNA表達顯著高于miR-control組和NC組(P<0.05)，表明miR-8已成功轉染至IOMM-Lee細胞內。miR-8組轉染后24 h、48 h、72 h的細胞抑制率均顯著低于miR-control組、NC組(P<0.05)，表明miR-8能抑制IOMM-Lee腦膜瘤細胞增殖。miR-8組細胞克隆數目顯著少于miR-Control組和NC組(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-8 RNA表達水平、不同時間點細胞增殖抑制率及細胞克隆數目比較

與miR-8 組比較：1)P<0.05；表2同

2.3 miR-8的靶基因預測與驗證 腦膜瘤組織中RAC1 mRNA相對表達水平顯著高于瘤旁組織(0.74±0.16 vs 0.28±0.08，P<0.001)，KLF2 mRNA在腦膜瘤組織、瘤旁組織中的表達分別為(2.23±0.45、1.98±0.36)，無統計學差異(P>0.005)。miR-8組熒光素酶表達及RAC1 mRNA顯著低于miR-control組和NC組(P<0.05)，見表2，表明RAC1可能是miR-8的靶基因。

表2 各組熒光素酶及RAC1 mRNA 表達比較

3 討 論

腦膜瘤發病率占顱內腫瘤的13%～26%，是常見的顱內腫瘤之一，世界衛生組織(WHO)將腦膜瘤分為良性腦膜瘤、非典型性腦膜瘤和惡性腦膜瘤，對應分級為Ⅰ～Ⅲ級〔8，9〕，手術切除是腦膜瘤治療首選方法，但惡性腦膜瘤具有生長快、侵襲性強等特點，手術切除、放化療及立體定向外科治療等效果欠佳〔10～12〕。因此，了解腦膜瘤發病機制將有助于精確治療、改善預后。

miRNAs通過與靶基因相互作用而抑制靶基因的表達，從轉錄和翻譯水平對靶基因進行調控〔13〕。有學者〔14〕報道miR-145能抑制IOMM-Lee腦膜瘤細胞增殖、侵襲能力，表明MicroRNAs可能與腦膜瘤的發生發展密切相關，miR-8是miRNA家族成員之一，研究證實miR-8可能與腫瘤的發生、轉移、侵襲等密切相關〔7〕。本研究通過地高辛標記的miR-8探針進行原位雜交，結果顯示miR-8在腦膜瘤組織中的表達低于瘤旁組織，在Ⅲ級惡性腦膜瘤中表達最低。表明miR-8在腦膜瘤中呈低表達狀態，表達水平與WHO分級呈負相關。而且，miR-8 mimics轉染IOMM-Lee細胞后，細胞增殖活性受到抑制、細胞克隆數目減少，從細胞水平亦證實miR-8過表達抑制腦膜瘤細胞增殖，因此，可以推測miR-8可能與腦膜瘤發生發展及惡性程度有關。

RAC1在細胞內廣泛表達〔15〕，定位于人染色體7p22，是Rho-GTPase家族的主要成員之一〔16〕，有研究發現RAC1能夠誘導聚集肌動蛋白微絲，促進腫瘤生長及侵襲轉移，是細胞癌基因之一〔17〕，miR-204、miR-142-3p、miR-124等miRNAs通過靶向調控RAC1促進肝癌、胰腺癌、前列腺癌的轉移、侵襲〔18，19〕。TargetScan是預測miRNAs靶基因的重要生物信息平臺，通過堿基配對匹配可能靶基因。本研究發現RAC1可能是miR-8的靶基因，miR-8 mimics轉染IOMM-Lee細胞后，RAC1表達明顯減少，雙熒光素酶結果也證實了miR-8通過與RAC1的3′UTR區結合，下調靶基因RAC1的表達。RAC1的主要作用是控制細胞生長、重組細胞骨架，RAC1通過作用PAK1激活激酶，調節肌動蛋白細胞骨架重建，在肌動蛋白細胞骨架集合和解離過程中起重要作用〔20〕；RAC1通過在G1期調節周期蛋白D1，進而阻滯細胞周期進程〔21〕，本實驗中，miR-8 mimics轉染IOMM-Lee細胞后，RAC1表達明顯減少，細胞的增殖受到抑制、細胞克隆數目減少，表明miR-8可能通過下調靶基因RAC1表達，從而抑制IOMM-Lee腦膜瘤細胞增殖。

綜上，miR-8在腦膜瘤組織中的低表達，miR-8通過與靶基因RAC1的3′UTR區結合，下調靶基因RAC1的表達，從而抑制IOMM-Lee腦膜瘤細胞增殖，為腦膜瘤發病機制的研究提供新的研究方向。