堿提酸沉法提取牡丹籽餅中蛋白質的研究

徐 玥，張存勞，楊 耿，劉 凱，馮鎖民

(1.西安醫學院 藥學院，西安 710021； 2.西安中糧工程研究設計院有限公司，西安 710082)

牡丹籽油是油用牡丹籽經加工得到的植物油，已被國家批準為新資源食品，其不飽和脂肪酸含量為82.81%～93.23%，明顯高于其他普通食用植物油[1-3]。陜西油用牡丹種植面積已達4萬hm2，全國排名第二，且種植面積還在逐年擴大。然而作為牡丹籽油生產的副產物牡丹籽餅，目前主要作為飼料、肥料或者廢棄，造成資源浪費[4]。牡丹籽餅中富含油脂、多糖、蛋白質、多酚類等多種成分[5]，針對餅中油脂[6]、多糖[7]的綜合利用開發已有文獻報道，研究結果為油用牡丹資源產業鏈延伸提供了依據。但牡丹籽餅中蛋白質研究報道較少，牡丹籽餅中蛋白質含量達26.98%[6]，可作為天然植物蛋白來源，也可作為生物活性肽的良好來源。目前蛋白質的常用提取方法有堿提酸沉法、水提法、鹽析法等，其中堿提酸沉法工業化生產應用較多。因此，本研究以牡丹籽餅為原料，采用堿提酸沉法結合單因素試驗和正交試驗優化蛋白質提取工藝條件，以期為牡丹籽蛋白綜合利用和功能性研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽餅，陜西產牡丹籽不脫殼經熱壓榨獲得；石油醚(60～90℃)、磷酸、95%乙醇、氫氧化鈉，均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250，天津市科密歐化學試劑有限公司；牛血清球蛋白V(純度≥98%，批號B21882)，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸，分析純，四川隴西化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

BT125型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，北京市光明醫療儀器廠；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責任有限公司；KH7200DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；TD5M型低速大容量離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Cary60型紫外分光光度儀，Agilent Technologies UV-Vis。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹籽餅脫脂處理[8]

牡丹籽餅粉碎后，過60目篩，低溫干燥，以石油醚為溶劑，采用索氏提取法脫脂，備用。經凱氏定氮法測定，其蛋白質含量為21.1%。

1.2.2 牡丹籽蛋白的提取

脫脂牡丹籽粉→加一定pH的堿液→恒溫振蕩提取→離心(3 500 r/min，10 min)→上清液(蛋白提取液)調pH→離心→沉淀水洗至中性→牡丹籽蛋白。

1.2.3 牡丹籽蛋白提取率的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

采用考馬斯亮藍法。精密稱取考馬斯亮藍G250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇，再加85%磷酸溶液100 mL，蒸餾水稀釋定容至1 000 mL，備用。精密稱取牛血清球蛋白V 0.005 50 g，加蒸餾水定容至25 mL，并稀釋成系列質量濃度(22、44、66、88、110、132、152 μg/mL)的標準工作液，備用。分別取不同質量濃度的標準工作液1 mL，再分別加入5.0 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻，放置5 min，于595 nm下測定吸光度(A)。以牛血清球蛋白V質量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，擬合得回歸方程。

1.2.3.2 牡丹籽蛋白提取液中蛋白質含量的測定

精密移取牡丹籽蛋白提取液1 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻，放置5 min，于595 nm下測定吸光度。代入標準曲線回歸方程，得到牡丹籽蛋白提取液中蛋白質含量。

1.2.3.3 蛋白提取率的計算

蛋白提取率=蛋白提取液體積×蛋白提取液中蛋白質含量/(原料質量×原料中蛋白質含量)×100%

1.2.4 牡丹籽蛋白酸沉pH的確定

取牡丹籽蛋白提取液，在25℃下分別將其pH調至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，靜置1 h后離心(3 500 r/min，10 min)，沉淀水洗至中性，真空干燥至恒重。由下式計算蛋白沉淀率，進而確定酸沉pH。

沉淀率=沉淀質量/(蛋白提取液質量×提取液中蛋白質含量)×100%

2 結果與分析

2.1 蛋白標準曲線的回歸方程

按照1.2.3.1繪制標準曲線，擬合得回歸方程A=6.663 9C+0.022(r=0.999 5)，牛血清球蛋白V質量濃度在22～152 μg/mL范圍內線性關系良好。方法學考察表明：精密度RSD為0.80%(n=6)；6 h內顯色穩定性RSD為1.65%(n=6)；重復性RSD為2.0%(n=6)；平均加標回收率為95.28%、RSD為2.82%(n=9)。說明該方法可以用作蛋白質含量的測定。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對牡丹籽蛋白提取率的影響

在提取溫度40℃、提取時間60 min、堿液pH 8.0條件下，考察料液比(1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8、1∶ 10、1∶ 12)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖1。由圖1可知，牡丹籽蛋白提取率隨料液比增加呈先增大后減小的趨勢。

圖1 料液比對牡丹籽蛋白提取率的影響

2.2.2 提取溫度對牡丹籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶ 8、提取時間60 min、堿液pH 8.0條件下，考察提取溫度(45、50、55、60、65℃)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖2。

圖2 提取溫度對牡丹籽蛋白提取率的影響

由圖2可知，牡丹籽蛋白提取率隨提取溫度升高呈先增大后減小的趨勢。隨著提取溫度的升高，蛋白質溶解增加和水分子運動的加劇促進了蛋白質的溶出。當提取溫度超過50℃時，提取率降低，其原因可能是溫度過高破壞了蛋白質的結構，導致部分蛋白質變性[9]。

2.2.3 提取時間對牡丹籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶ 8、提取溫度55℃、堿液pH 8.0條件下，考察提取時間(40、60、80、100、120 min)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖3。由圖3可知，牡丹籽蛋白提取率隨提取時間延長呈先增大后減小的趨勢，當提取時間達60 min時，提取率達最大值。

圖3 提取時間對牡丹籽蛋白提取率的影響

2.2.4 堿液pH對牡丹籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶ 8、提取溫度55℃、提取時間60 min條件下，考察堿液pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖4。由圖4可知，牡丹籽蛋白提取率隨堿液pH增加呈先增大后減小的趨勢，當pH大于8.0時提取率呈下降趨勢，可能是由于強堿環境破壞了蛋白質結構[10]。

圖4 堿液pH對牡丹籽蛋白提取率的影響

2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果進行正交試驗設計，選擇料液比(A)、堿液pH(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)為考察因素，各取3個水平，利用L9(34)正交表設計正交試驗。 正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知，4個因素對牡丹籽蛋白提取率的影響順序依次為A>D>B>C(料液比>提取時間>堿液pH>提取溫度)。最優水平組合為A3B2C1D3，綜合考慮2.2.3項試驗結果和節能減耗，最終確定最佳提取工藝條件為A3B2C1D2，即料液比1∶ 12、堿液pH 8.5、提取溫度45℃、提取時間60 min。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

2.4 驗證試驗

根據正交試驗得到的最佳提取工藝參數，進行3次平行驗證試驗，測得牡丹籽蛋白提取率依次為78.19%、78.22%、78.28%，平均值為(78.23±0.04)%。

2.5 牡丹籽蛋白酸沉pH

取最佳工藝條件下獲得的牡丹籽蛋白提取液，按1.2.4操作，不同pH對應的蛋白沉淀率如圖5所示。由圖5可知，隨著pH增大蛋白沉淀率呈先增大后減小趨勢。當pH為4.0時蛋白沉淀率最大，達(90.90±0.11)%。因此，選擇牡丹籽蛋白酸沉條件為pH 4.0。

圖5 酸沉條件對蛋白沉淀率的影響

3 結 論

在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化牡丹籽餅中蛋白質的堿提酸沉提取工藝條件。確定最佳工藝條件為：料液比1∶ 12，堿液pH 8.5，提取時間60 min，提取溫度45℃。在最佳工藝條件下牡丹籽蛋白提取率為(78.23±0.04)%；牡丹籽蛋白最佳酸沉條件為pH 4.0，此時蛋白沉淀率達(90.90±0.11)%。