微波輔助生物解離法提取大豆油工藝及作用機理研究

孫禹凡，齊寶坤，廖 一，楊樹昌，鐘明明，董天玉，李 楊

(東北農業大學 食品學院，哈爾濱 150030)

現階段，大豆油主要通過機械壓榨法或溶劑浸提法進行提取，盡管兩種提油方式各有優勢，但機械壓榨法提油率較低且熱榨會使蛋白質變性，造成大豆蛋白難以提取出來應用于食品生產。而溶劑浸提法雖然提油率較高(>95%)，但浸提溶劑會造成化學污染，易燃[1-2]。生物解離法(EAEP)作為一種無溶劑殘留、綠色、安全的加工工藝受到人們廣泛關注，其可實現油料中油脂和蛋白質的同步提取[3]。

生物解離法提取油脂的過程中，油料預處理對油脂提取效果影響較為顯著。國內外有很多關于微波輔助提油的研究，微波輔助提油能有效提高油脂得率，并能有效抑制脂肪酸及脂肪氧化酶活力[4]。Fatiha等[5]利用微波輔助溶劑浸提法提取橄欖油，發現與傳統溶劑浸提法相比，該方式所需時間短，油脂得率高，且溶劑使用量較少。Taghvaei等[6]利用微波輔助溶劑浸提法對棉籽油進行提取，研究表明微波輔助提取方式在縮短提取時間和降低溶劑用量的同時，提高了棉籽油的儲藏穩定性。劉彬球[7]利用微波輔助水酶法提取普洱茶籽油，所得普洱茶籽油不飽和脂肪酸含量高于壓榨法，說明微波輔助提取能夠較好地保持油脂的營養價值。

本文通過微波輔助生物解離法提取大豆油，尋求最優提取工藝并探討微波輔助處理對大豆油提取的影響，旨在得到一種酶制劑用量低，油脂提取率高的提取工藝，為生物解離法提取大豆油工藝的產業化提供理論依據和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

墾農-47大豆，黑龍江省農業科學院；Protex 6L 堿性蛋白酶，美國杰能科酶制劑公司；氫氧化鈉、鹽酸、正己烷、酚酞指示劑、硼酸、硫酸銅、甲醇、三氯化硼、重鉻酸鉀、無水硫酸鈉等均為分析純。

SLGPHJLA雙螺桿擠壓膨化機；AL104 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Apex常壓微波快速反應系統；RET control-visc磁力攪拌器，德國IKA公司；HH-S6電熱恒溫水浴鍋；Sigma 3-16KL冷凍離心機，德國西格瑪公司；DHG-9425A電熱恒溫鼓風干燥箱；羅維朋比色計；DX-201透射電鏡；PerkinElmer Raman Station 400 拉曼光譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 微波輔助生物解離法提取大豆油

1.2.1.1 工藝流程

大豆→粉碎→真空擠壓膨化→膨化大豆粉→加水混合→混合液→微波處理→酶解→滅酶→離心分離→

1.2.1.2 工藝要點

采用王心剛等[8]水酶法提取大豆油工藝并進行適當修改。大豆經清理、粉碎后，進行真空擠壓膨化預處理，真空擠壓膨化工藝條件為套筒溫度87℃、真空度-0.067 MPa、模孔孔徑22 mm、螺桿轉速91 r/min、物料含水率16%。將得到的擠壓膨化大豆粉過60目篩，準確稱量一定質量過篩后的擠壓膨化大豆粉放入燒杯中，加水攪拌均勻形成混合液。將混合液在一定微波功率下處理一定時間，置于55℃的恒溫水浴鍋中，用1 mol/L NaOH溶液調節混合液的pH至9.0并保持不變，然后加入一定量Protex 6L堿性蛋白酶進行酶解，酶解過程中保持混合液pH不變并不斷攪拌酶解3 h，隨后于95℃下加熱5 min滅酶得到酶解液，將酶解液冷卻至室溫后在4 500 r/min轉速下離心20 min，得到游離油、乳狀液、水解液、殘渣，分離游離油和乳狀液，將乳狀液冷凍解凍破乳，收集游離油，將游離油置于棕色玻璃瓶內保存，用于后續研究。

將水解液用2 mol/L NaOH調節pH至8.5， 50℃攪拌1.5 h后，將其懸浮液在4℃條件下10 000×g離心20 min，取上清液再用2 mol/L HCl調節pH至4.5。靜置后在4℃條件下6 000×g離心20 min，取蛋白沉淀水洗2次，最后將沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調節pH至7.0。將此蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀分離蛋白。

1.2.2 總油脂提取率的測定

大豆中油脂含量按GB/T 5512—2008進行測定。殘渣中油脂含量測定：將殘渣用1 mol/L NaOH溶液調節pH至9.0并保持不變，加入1% Protex 6L堿性蛋白酶混合后進行酶解，酶解過程中保持混合液pH不變并不斷攪拌酶解3 h，隨后于95℃下加熱5 min滅酶得到酶解液，將酶解液冷卻至室溫后在4 500 r/min轉速下離心20 min，得到殘渣中的游離油，稱重，按下式計算總油脂提取率。

總油脂提取率=(原料大豆質量×大豆中油脂含量-生物解離后殘渣中油脂質量)/(原料大豆質量×大豆中油脂含量)×100%

1.2.3 大豆油理化性質的測定

色澤，參照AOCS Official Method Cc 13e-92方法測定；折光指數，參照GB/T 5527—2010方法測定；酸價，參照GB/T 5530—2005方法測定；過氧化值，參照AOCS Official Method Cd 8-53方法測定；游離脂肪酸含量，參照AOCS Official Method Ca 5a-40方法測定；p-茴香胺值，參照AOCS Official Method Cd 18-90方法測定；不皂化物含量，參照AOCS Official Method Ca 6a-40方法測定；磷脂含量，參照GB/T 5537—2008方法測定。每個樣品測定3次。

1.2.4 透射電鏡分析

透射電鏡分析參照韓宗元等[9]方法：前固定→漂洗→后固定→漂洗→50%乙醇脫水→70%乙醇脫水→90%乙醇脫水→100%乙醇脫水→100%乙醇和100%丙酮(1∶1)脫水→100%丙酮脫水→100%丙酮和包埋液(3∶1)浸透→包埋→聚合→修塊→超薄切片機切片→染色→觀察、拍片。

1.2.5 拉曼光譜分析

拉曼光譜分析參照畢爽等[10]方法：將大豆蛋白分散在緩沖液中并配制成100 mg/mL溶液進行拉曼光譜測定，拉曼光譜的激發光波長為785 nm,發射功率為300 mW，測量拉曼光譜范圍選取600～1 800 cm-1。每個樣品重復掃描3次，各樣品的拉曼譜圖都是由計算機作信號累加后平均，并繪圖輸出，峰位誤差小于±3 cm-1。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對總油脂提取率的影響

在微波時間6 min、Protex 6L添加量1.2%、液料比5∶1的條件下，微波功率對總油脂提取率的影響如圖1所示。

由圖1可以看出，在400～800 W的范圍內，隨著微波功率的增加，總油脂提取率呈現先升高后降低的趨勢，在微波功率700 W時，總油脂提取率達到最高，這與楊全勝[11]利用微波輔助提取葡萄籽油的研究結論一致。這可能是由于在相同微波時間及酶添加量條件下，微波功率越高，其提供能量越高，物料內部溫度上升越快，內部壓力大造成細胞破裂，油脂溶出增加。在較低微波功率下，微波提供的能量僅用于加熱，不足以破壞細胞壁。而當微波功率過高時，會使反應釜內溫度短時間內迅速上升，而溫度較高使物料內部組分發生糊化，蛋白組分發生變性，阻礙油脂釋放進程[12]。綜合考慮，在優化微波功率時選擇700 W作為中心點。

圖1 微波功率對總油脂提取率的影響

2.1.2 微波時間對總油脂提取率的影響

在微波功率600 W、Protex 6L添加量1.2%、液料比5∶1的條件下，微波時間對總油脂提取率的影響如圖2所示。

圖2 微波時間對總油脂提取率的影響

由圖2可以看出，在2～10 min的范圍內，隨著微波時間的延長，總油脂提取率呈現逐步上升的趨勢，該趨勢與胡濱等[13]利用微波輔助法提取松籽油所得結論一致。這可能是由于微波處理過程中，持續輸出能量，細胞內物質吸收能量增加了細胞內部壓力，使細胞壁破裂，油脂溶出增加。在2～6 min時總油脂提取率上升速度較快，當微波時間超過6 min時，上升速度較為緩慢，這可能是由于微波處理在較短時間內對細胞破裂效果較好，加速油脂溶出，且隨著微波時間的繼續延長，會造成反應體系溫度升高，而溫度升高會增加油脂的溶解度，降低油脂的黏度，因此會產生總油脂提取率持續增加的結果[5]。而隨著微波時間繼續延長，細胞破裂程度趨于完全，總油脂提取率增加速度較為平緩。綜合考慮，在優化微波時間時選擇6 min作為中心點。

2.1.3 Protex 6L添加量對總油脂提取率的影響

在生物解離法提取大豆油過程中，蛋白酶Protex 6L可以酶解油脂蛋白體系，且在55℃、pH 9.0時具有最強活性，可以使油脂得到充分釋放[14]，酶的添加量會直接影響油脂提取效果和提取工藝成本，因此選擇合適的酶添加量是十分必要的。在微波功率600 W、微波時間6 min、液料比5∶1的條件下，Protex 6L添加量對總油脂提取率的影響如圖3所示。

圖3 Protex 6L添加量對總油脂提取率的影響

由圖3可知，Protex 6L添加量在0.4%～2.0%范圍內，總油脂提取率總體呈上升趨勢，當Protex 6L添加量達到0.8%后繼續增加Protex 6L添加量，總油脂提取率增加趨勢較為緩慢。這是由于酶作用于底物，當底物被作用完全，過量的酶就無法繼續酶解蛋白釋放油脂。綜合考慮，在優化Protex 6L添加量時選擇0.8%作為中心點。

2.1.4 液料比對總油脂提取率的影響

在微波功率600 W、微波時間6 min、Protex 6L添加量1.2%的條件下，液料比對總油脂提取率的影響如圖4所示。

圖4 液料比對總油脂提取率的影響

由圖4可知，在液料比3∶1～7∶1范圍內，隨著液料比的增加，總油脂提取率也不斷增加，當液料比達到5∶1時，增長趨勢開始緩慢。這可能是由于底物質量一定，當增加液料比時，底物與水的接觸面積增加，使浸提液中的蛋白酶能夠充分作用于底物，并且增加固液濃度差。當液料比增加到一定程度，再增加水的量，造成總油脂提取率增加緩慢可能是由于浸提液對微波能量的吸收導致細胞吸收能量變少[15]。綜合考慮，在優化液料比時選擇5∶1作為中心點。

2.2 響應面試驗

2.2.1 模型建立與方差分析

在單因素試驗基礎上，應用Box-Behnken設計原理，以微波功率、微波時間、Protex 6L添加量、液料比4個因素作為反應因素，以總油脂提取率為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗，優化微波輔助生物解離法提取大豆油工藝條件。響應面試驗因素與水平見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平

表2 響應面試驗設計及結果

利用Design-Expert軟件，對表2中試驗數據進行多元擬合，得到總油脂提取率(Y)對微波功率(X1)、微波時間(X2)、Protex 6L添加量(X3)和液料比(X4)的二次多項回歸方程模型為：

對該模型進一步進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析

2.2.2 響應面分析與優化

在上述回歸方程基礎上，經過計算確定微波輔助生物解離法提取大豆油的最佳工藝條件為微波功率702.02 W、微波時間7.59 min、Protex 6L添加量0.93%、液料比5.15∶1，在此條件下總油脂提取率的預估值為92.48%。考慮實際操作可行性，將上述條件修正為微波功率700 W、微波時間7.6 min、Protex 6L添加量0.90%、液料比5.15∶1，在此條件下進行3次平行試驗，得到總油脂提取率平均值為92.13%，試驗結果與模型預估值較為接近，說明該模型具有一定參考價值。

2.3 大豆油的理化指標

在最優條件下采用微波輔助生物解離法提取大豆油，其理化指標測定結果見表4。

表4 微波輔助生物解離法大豆油的理化指標

由表4可知，利用微波輔助生物解離法提取的大豆油品質較好，其酸價及過氧化值均滿足GB/T 1535—2017一級大豆油要求，p-茴香胺值較低。過氧化值和p-茴香胺值分別是檢測初級氧化產物和次級氧化產物的指標，較低的過氧化值和p-茴香胺值是令人期望的。這是因為微波處理大豆過程中發生美拉德反應，并產生具有抗氧化活性的物質進入到大豆油中[16]，所以生物解離法提取的大豆油氧化程度較低。微波輔助生物解離法提取的大豆油中磷脂含量也較低，這是由于磷脂在水存在的環境下更易與水形成化合物而不溶于油，所以在生物解離的環境下，大量磷脂與水形成乳狀物，溶于油的磷脂量減少[17]。但微波輔助生物解離法提取大豆油，提取率較溶劑浸提法低，且存在成本高等問題，還需進一步研究。

2.4 透射電鏡分析

由響應面分析結果可知，微波時間是對總油脂提取率影響最大的因素，因此考察了不同微波時間處理大豆的透射電鏡變化，結果見圖5。

圖5 大豆細胞透射電鏡圖

由圖5可知，大豆經過微波處理后，細胞壁結構破壞較充分，細胞與細胞之間相互聚集融合。在微波處理大豆過程中，大豆細胞壁由于內部物質吸收能量使細胞內部壓力增加，進而造成細胞壁破裂[18]。對比微波處理前后透射電鏡圖可知，微波增大了大豆組織結構的破裂程度，且隨著微波處理時間的延長，大豆內部結構破裂的程度也增加，大豆細胞壁組織發生更為明顯的破裂是總油脂提取率增大的重要原因[19]。

2.5 大豆蛋白二級結構的拉曼光譜分析

蛋白的構象主要由酰胺I帶的拉曼特征峰確定，酰胺I帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋結構，1 645～1 660 cm-1;β-折疊結構，1 665～1 680 cm-1;β-轉角結構，1 680～1 690 cm-1；無規則卷曲結構，1 660～1 670 cm-1[20]。經對提取的大豆蛋白拉曼光譜中酰胺I帶特征峰的4個結構進行定量分析，得到的大豆蛋白質的二級結構含量見表5。

表5 微波時間對大豆蛋白二級結構影響的拉曼光譜分析

由表5可知，隨著微波時間由2 min延長至8 min，大豆蛋白α-螺旋結構含量由29.54%降低至25.44%，β-折疊結構由26.02%降低至19.59%，而無規則卷曲結構及β-轉角結構分別由26.39%、18.05%升高至34.45%和20.52%。微波時間延長引起的無規則卷曲結構的增加與微波處理導致蛋白質變性有關，微波時間的延長會引起反應環境溫度的升高，因而進一步促使蛋白質發生較為明顯的變性[21]。微波時間達到6 min后，大豆蛋白的β-折疊結構下降及無規則卷曲結構增加趨勢相對明顯，這可能是由于微波處理達到一定時間，增加細胞破裂外，還會由于反應環境溫度的升高使得蛋白質變性，使蛋白質更易被酶解，大豆油的提取率逐漸增加。

3 結 論

本試驗以微波輔助生物解離法對大豆油進行提取，在單因素試驗基礎上，利用響應面法建立了微波功率、微波時間、Protex 6L添加量、液料比4個單因素對總油脂提取率的影響模型，各因素對響應值的影響從大到小依次為微波時間、Protex 6L添加量、液料比、微波功率。得到微波輔助生物解離法提取大豆油的最佳工藝參數為微波功率700 W、微波時間7.6 min、Protex 6L添加量0.90%、液料比5.15∶1，在此條件下總油脂提取率為92.13%。利用微波輔助生物解離法提取的大豆油品質較好，過氧化值、p-茴香胺值及磷脂含量較低。由透射電鏡圖可以看出，大豆經過微波處理后，大豆細胞壁組織發生更為明顯的破裂是總油脂提取率增大的重要原因。拉曼光譜分析表明，經過微波處理后蛋白質發生變性，也是增加總油脂提取率的原因之一。