貝伐珠單抗改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化

黃超文 趙強 鐘蓮娣 先俊 鐘雪鶯 仝金齋 黃炎明

江門市中心醫院呼吸內科一區（廣東江門 529000）

肺纖維化是間質性肺病中最常見的一種類型，具有高病死率和日益增長的發病率，但目前仍缺乏有效的治療手段。肺纖維化的病理特征為肺泡上皮損傷、異常的血管修復和重塑、炎癥浸潤、肺成纖維細胞細胞增殖活化及肺間質膠原沉積，但其發病機制尚不清楚。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）目前被認為是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子。近年來，研究發現VEGF不僅參與全身的血管生成，還與多種肺部疾病相關，其與肺纖維化的聯系也日漸受到關注。研究顯示轉入抗VEGF的sflt-1基因可抑制博來霉素（Bleomycin，Blm）誘導的小鼠肺纖維化[1]，提示VEGF在纖維化進程中具有重要作用。同時活性維生素D 1，25（OH）2D3（VD）在慢性氣道疾病中的作用亦被逐漸證實，VD具有可抑制VEGF對氣道屏障的破壞[2]、氣道平滑肌細胞增殖[3]、促腫瘤細胞遷移[4]和改善肺纖維化[5]等作用。由于目前多種VEGF的抑制劑已上市，而貝伐珠單抗（Bevacizumab，Bev）始終是現有的確切有效且安全的VEGF抑制性藥物[6-8]。結合本課題組已發現VD可減輕肺纖維化[5]，Bev可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥[9]，因此，本研究在前期肺纖維化研究基礎上，采用VD作為對照，在博來霉素誘導肺纖維化小鼠模型中首次探討Bev對肺纖維化的影響，評價其是否可特異性抑制VEGF，為肺纖維化的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 動物與材料SPF級C57B/L小鼠共40只（購自廣東省醫學動物實驗中心），6～8周齡，體重20～24 g，飼養于南方醫科大學動物實驗中心。VEGF-A、TNF-α、IL-4 Elisa試劑盒購自 eBioscience；HE染色試劑盒、羥脯氨酸含量測定試劑盒、DAB顯色試劑盒，α-SMA抗體（abcam）。

1.2 分組處理將小鼠隨機分為4組：對照組（Con組）、博來霉素誘導肺纖維化組（Blm組）、博來霉素誘導肺纖維化后1，25（OH）2D3治療組（Blm+VD組）、博來霉素誘導肺纖維化后貝伐珠單抗治療組（Blm+Bev組）。具體方法：腹腔注射1%戊巴比妥麻醉小鼠，Blm組氣管內單次注射3U/Kg Blm以制備肺纖維化小鼠模型；Con組經氣管內單次注射等體積生理鹽水；Blm+VD及Blm+Bev組：造模過程同Blm組，造模成功后每日經腹腔注射5 μg/kg VD或經鼻滴入5 mg/kg貝伐珠單抗；VD或貝伐珠單抗治療第21天，摘取眼球放血處死小鼠并收集、保存肺組織及肺泡灌洗液。

1.3 肺纖維化程度評定肺組織H&E染色、肺纖維化評分（Ashcroft評分）、羥脯氨酸含量測定、α-SMA免疫組化。

1.4 細胞因子檢測收集肺支氣管肺泡灌洗液（BALF），經離心后取上清，Elisa法檢測VEGF-A、IL-4、TNF-α。

1.5 統計學分析使用SPSS 19.0進行統計和分析，計量資料以均數±標準差表示，方差齊時采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較應用Bonferroni法；不滿足方差齊性時使用Welch法比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BALF中VEGF-A的表達Blm組小鼠的BALF中VEGF-A含量明顯升高，與Con組相比差異具有統計學意義（P＜0.05）。Blm+VD組和Blm+Bev處理的纖維化小鼠的VEGF-A表達均有所減少，其中以Blm+Bev組下降更為明顯，與Blm組對比差異均有統計學意義（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 各組小鼠肺組織病理結果如圖2-A所示，Con組小鼠的肺泡結構完整，肺組織未見炎癥細胞浸潤或膠原纖維沉積。博來霉素可成功制備肺纖

圖1 各組小鼠BALF VEGF-A表達情況Fig.1 The expression of VEGF-A in BALF of mice

維化小鼠動物模型，表現為Blm組小鼠肺組織難以看見正常肺泡結構，肺泡間質中膠原纖維大量沉積，成纖維細胞增生聚集、大量炎癥細胞浸潤（淋巴細胞、巨噬細胞），Ashcroft纖維化評分平均約為5分（圖2-B）。Blm+Bev組和Blm+VD組仍可見部分正常排列而完整的肺泡，其肺間質中炎癥細胞明顯減少，膠原纖維增生較輕，對比Blm組，兩組纖維化評分降低（P＜0.05）。與Con組相比，Blm組小鼠羥脯氨酸含量明顯增加，差異具有統計學意義；Blm+Bev組和Blm+VD組的羥脯氨酸含量均較Blm組有下降，差異具有統計學意義，但Blm+VD組與Blm+Bev組之間比較未見統計學意義（P＞0.05，圖2-C）。Blm+Bev組及Blm+VD組肺組織中膠原增生較Blm組有減輕，這與HE染色、Ashcroft評分結果是一致的。

2.3 肺組織α-SMA表達免疫組化顯示Blm組小鼠肺組織α-SMA含量明顯增加，呈廣泛分布的棕黃色，Blm+VD組與Blm+Bev組小鼠的α-SMA陽性細胞明顯減少（圖3）。

2.4 BALF中炎癥因子表達Blm組小鼠可造成BALF中TNF-α、IL-4含量均顯著增高，對比Con組小鼠，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Blm+Bev組及Blm+VD組的BALF中TNF-α、IL-4含量較Blm組明顯下降（均P＜0.05）；Blm+VD組與Blm+Bev組兩組間比較均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

3 討論

肺纖維化目前治療手段仍十分有限，目前研究主要針對減輕炎癥反應和抑制肺成纖維細胞細胞增殖活化及肺間質膠原沉積，本研究首次證明抑制VEGF可減輕博來霉素所致的肺組織炎癥細胞浸潤、肺成纖維細胞活化及膠原纖維的增生，從而抑制肺纖維化的形成和發展。

圖2 各組小鼠肺纖維化情況Fig.2 The effect of pulmonary fibrosis in mice

圖3 各組小鼠α-SMA免疫組化結果Fig.3 Immunohistochemical staining of α-SMA in mice

氣管內注射博來霉素是肺纖維化小鼠模型的最經典的造模方式[10]。本研究經氣管內注射博來霉素的小鼠的肺組織可見正常肺結構大面積被破壞、肺泡間隔增厚，肺間質嚴重炎癥細胞浸潤和細胞外基質如膠原纖維的增生，這表明已成功構建小鼠肺纖維化模型。本研究發現博來霉素誘導的肺纖維化小鼠的BALF中VEGF-A含量升高，這與國外研究結果[7-8]是一致的。VEGF-A是VEGF家族中最受關注的一種亞型，VEGFR-2是其主要受體。Bev可通過與VEGFR-2競爭性結合VEGF-A，從而抑制VEGF-A的作用[9]。既往認為，VEGF-A主要作用為促血管新生和調節血管通透性，然而近2年研究發現VEGF-A參與更多的肺部疾病中，如哮喘[2，9]、氣道重塑[3]、急性肺損傷[10]、肺癌[11]等，其在肺纖維化中的作用更是備受爭論的熱點。本研究發現Bev可明顯減少小鼠BALF中VEGF-A的表達，其含量甚至低于正常小鼠，這提示其對VEGF的有效抑制作用。更重要的是，貝伐珠單抗處理后小鼠的肺組織肺泡紊亂破壞、膠原病理性沉積得到有效改善，免疫組化結果顯示肺部纖維化標志蛋白α-SMA的表達明顯下降、成纖維細胞增殖活化也受到抑制。其作用效果與VD相近，證明貝伐珠單抗具備抗肺纖維化的潛能。值得注意的是，具有抗纖維化作用的VD處理后，小鼠BALF中的VEGF-A含量下調。VD可在多種細胞模型中調節VEGF的表達，例如可抑制氣道平滑肌細胞、氣道上皮細胞釋放VEGF，從而參與哮喘的發生。這進一步提示VEGF-A參與肺纖維化的發生發展，而VD可能部分通過調節VEGF發揮對肺纖維化的保護性作用。

圖4 小鼠BALF TNF-α、IL-4表達情況Fig.4 The expression of TNF-α，IL-4 in BALF of mice

肺成纖維細胞細胞過度活化、增殖、遷移一直是肺纖維化機制的研究重點。國外研究證明VEGF可促進成纖維細胞的功能：重組VEGF-A可直接刺激肺成纖維細胞分泌過量的細胞外基質[12]，VEGF的抑制劑可抑制人肺成纖維細胞遷移能力[3]。本研究在體內水平發現博來霉素組小鼠纖維化的肺組織中表達α-SMA陽性的細胞明顯增多、聚集成團，其中以纖維細胞表達為主，且單個細胞內α-SMA表達量明顯升高，成纖維細胞過度活化。而使用貝伐珠單抗抑制VEGF后，小鼠肺間質中成纖維細胞數目減少、α-SMA的表達也受到抑制，這些結果提示Bev對肺纖維化的具有確定的保護作用。學者發現VEGF也參與多種肺部炎癥相關性疾病如哮喘、ARDS等的發生。VEGF可促進哮喘模型中Th2炎癥因子的釋放[13]，激活經典炎癥信號通路-NF-κB信號通路，參與哮喘形成；Bev可抑制屋塵螨誘導氣道炎癥反應。本研究中Bev干預后小鼠肺部炎癥浸潤較造模組明顯減輕，而BALF中炎癥因子IL-4、TNF-α的表達也相應下降。這提示Bev可抑制肺部炎癥反應從而改善肺纖維化。但必須指出的是，博來霉素肺纖維化模型早期以炎癥反應占主導，后期以纖維化進程為主。因此，若要深入研究VEGF與肺炎癥反應在肺纖維化中的作用，須進一步觀察造模后第7、14天的小鼠炎癥因子變化。此外，由于本研究中僅探討其在炎癥因子及纖維化的病理改變情況，研究不足之處在于尚未探討成纖維細胞增殖活化與抑制VEGF的關系，因成纖維細胞增殖活化仍是目前治療纖維化的主要手段之一[14]。下一步擬進行成纖維細胞增殖活化與VEGF/VFGFR信號通路關系的研究。

綜上所述，本研究首次提出Bev可改善博來霉素誘導的肺纖維化，其作用機理與抑制VEGF對肺部炎癥、肺成纖維細胞活化和細胞外基質增生的作用相關。抑制VEGF可能成為治療肺纖維化的新思路。