多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附特性

姜飛虹，宋子涵，牛 晨，張宇翔，魏建平，岳田利,*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，農業部農產品質量安全風險評估實驗室（楊凌），國家農業綜合測試工程研究中心（楊凌），陜西 楊凌 712100；2.西北大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710000）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是由乳酸鏈球菌產生的一種羊毛硫氨酸細菌素，能夠有效地抑制革蘭氏陽性菌[1-2]。Nisin無毒、無味且熱穩定性較好，作為一種食品添加劑被廣泛地應用在乳制品、蛋類、蔬菜、肉制品和魚類等食品加工過程中，用來控制有害微生物的污染。然而，Nisin能夠與液體食品中的蛋白質、糖和酯類等物質發生反應，降低了它的抑菌活性，因此在液體食品中鮮少應用。更重要的是，Nisin作為天然食品抑菌劑噴灑在食品表面，由于長期暴露在微生物表面，可能導致耐藥菌的產生[3-4]。

因為磁性納米粒子（iron oxide nanoparticles，IONPs）具有比表面積大、磁選速度快、吸附能力高和經濟耐用等優點，已經成為一種重要的磁性材料，被廣泛應用在蛋白的固定化、酶的分離純化、重金屬吸附、染料去除以及靶向給藥等領域[5-6]。但是，因為磁性納米粒子表面能較大，容易發生聚沉和氧化，在實際應用中應對其表面進行修飾[7]。多巴胺是一種通用的表面修飾劑，只需簡單的步驟即可在材料表面形成聚多巴胺膜，合成方法和操作簡單、經濟，被廣泛地應用于生物材料的表面修飾[8]。

生物物質的吸附是一個復雜的過程，當Nisin被吸附到磁性納米粒子表面時，Nisin的結構和活性、吸附時間、吸附溫度以及吸附劑的表面性質等都會影響到吸附的效率[6]。

綜上所述，本研究通過測定不同溫度和時間下多巴胺磁性納米粒子（IONPs@pDA）吸附Nisin的含量，運用不同方程進行吸附動力學和吸附等溫線擬合，系統研究多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的機理和特性，以期為制備出既能保留Nisin抗菌活性又能夠快速磁分離防止耐藥菌產生的耦合體殺菌材料提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nisin（活力10 000 IU/mL）、多巴胺 美國Sigma公司；考馬斯亮藍 海博生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2～7.4）、硫酸亞鐵、硝酸鐵、三乙胺、甲醇和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均為分析純） 西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

RHD-160數顯強力恒速電自動攪拌機 常州市人和儀器廠；Victor X3多功能酶標儀 美國PE公司；FD5-3真空冷凍干燥機 美國西盟公司；QYC-2102C恒溫搖床上海福瑪實驗設備有限公司；UPHW-I優普系列超純水器優普實業儀器（上海）有限公司；AUY220萬分之一天平日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 多巴胺磁性納米粒子的制備

磁性納米粒子的制備：分別配制0.1 mol/L硫酸亞鐵和硝酸鐵溶液，以體積比1∶1混合于大燒杯中，用機械攪拌器攪拌30 min。隨后加入3 mmol/L SDS，繼續用機械攪拌器攪拌30 min，逐滴加入三乙胺（體積分數5%），大力攪拌2 h，整個過程均在攪拌下進行。在3 h的攪拌下，懸液由深棕色變為純黑色，即視為反應完成。磁性分離后重懸于超純水中，用超純水和甲醇反復清洗，經真空冷凍干燥，得到固體磁性納米粒子，以備后續實驗[9]。

多巴胺磁性納米粒子的制備：將固體多巴胺加入到PBS（10 mmol/L、pH 8.5）中，用機械攪拌器攪拌溶解，再加入制備好的磁性納米粒子，充分攪拌24 h。反應結束后，產物經磁性分離，重懸于超純水中，充分攪拌12 h，經真空冷凍干燥得到多巴胺磁性納米粒子，以備后續實驗[10]。

1.3.2 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin分析

1.3.2.1 Nisin標準曲線制作及含量的測定

用萬分之一天平準確稱取Nisin試劑0.010 0 g，用移液槍準確量取1 mL PBS（10 mmol/L、pH 6.86），充分溶解后作為Nisin標準溶液的母液。將母液依次稀釋至質量濃度為0.006 0、0.005 0、0.004 0、0.003 0、0.002 0、0.001 0、0.000 5 mg/mL，即為Nisin系列標準溶液。

準確量取20 μL Nisin標準溶液和待測樣品，加入100 μL考馬斯亮藍溶液，充分混合均勻并靜置5 min，用酶標儀在595 nm波長下測定混合液的吸光度，繪制Nisin標準曲線，計算待測樣品中的Nisin含量。每個樣品設置3 個平行實驗。

1.3.2.2 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附動力學分析

用萬分之一天平準確稱取0.080 0 g Nisin固體粉末，用20 mL PBS（10 mmol/L、pH 6.86）溶解。再準確稱取0.080 0 g多巴胺磁性納米粒子，加入到Nisin溶液中，將混合物分別放置在溫度為298、318、338 K的水浴鍋中恒溫振蕩吸附，在吸附時間為0、5、10、30、60、90、120、150、180 min時，量取20 μL吸附溶液，磁性分離后測定Nisin含量。每個測定溫度設置3 個平行實驗。

測定Nisin含量后，計算9 個時間點所對應的Nisin吸附量Qt，以時間t為橫坐標、吸附量Qt為縱坐標作圖，得到不同溫度下的吸附動力學曲線。

本實驗選擇了4 種動力學方程來進行吸附動力學過程的線性擬合，分別是Lagergren準一級反應動力學方程[11]、Lagergren準二級反應動力學方程[12]、Elovich方程[13]和內部擴散方程[14]。

Lagergren準一級反應動力學方程如式（1）所示。

式中：K1為Lagergren準一級反應動力學速率常數/min－1；Qt為吸附時間為t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；t為吸附時間/min。

Lagergren準二級反應動力學方程如式（2）所示。

式中：K2為Lagergren準二級反應動力學速率常數/（mg/（mg·min））；Qt為吸附時間為t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；t為吸附時間/min。

Elovich方程如式（3）所示。

式中：Qt為吸附時間為t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；α為反應初始吸附速率/（mg/（mg·min））；β為解吸常數/（mg/mg）。

內部擴散方程如式（4）所示。

式中：Qt為吸附時間t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；Kd為吸附反應的內部擴散速率常數/（mg/（mg·min1/2））；I為邊界層的厚度對吸附過程影響的常數/（mg/mg）。

1.3.2.3 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附等溫線分析

準確配制Nisin標準溶液，使其質量濃度依次為0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.003 0、0.004 0、0.005 0 g/mL。用萬分之一天平準確稱取0.004 0 g多巴胺磁性納米粒子，加入到1 mL配制好的Nisin溶液中，將混合物放置在溫度分別為298、318、338 K的水浴鍋中恒溫振蕩吸附，磁性分離后測定Nisin含量。每個測定溫度設置3 個平行實驗。

以吸附達到平衡時Nisin的質量濃度Ce為橫坐標、吸附量Qe為縱坐標作圖，繪制出不同溫度的吸附等溫線。吸附量Qt的計算如公式（5）[15]所示。

式中：Qt為吸附時間t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；C0為吸附反應中Nisin的初始質量濃度/（mg/mL）；Ct為吸附時間為t時Nisin的質量濃度/（mg/mL）；V為反應時Nisin溶液的總體積/mL；m為加入的多巴胺磁性納米粒子的質量/mg。

為了更深入地研究Nisin吸附反應過程中的平衡吸附關系，本實驗選擇了3 種吸附等溫方程進行擬合，依次是Langmuir吸附等溫方程[16]、Freundlich吸附等溫方程[8]和Temkin吸附等溫方程[17]。

Langmuir吸附等溫方程如式（6）所示。

式中：Qm為單分子層趨于飽和時的理論吸附量/（mg/mg）；Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；Ce為吸附達到平衡時Nisin的質量濃度/（mg/mL）；KL為朗繆爾常數/（mL/mg）。

朗繆爾吸附等溫模型的另一種表達方式是用分離系數RL來表示，如式（7）所示。

式中：C0為吸附反應中N i s i n的初始質量濃度/（mg/mL）；KL為朗繆爾常數/（mL/mg）。

Freundlich吸附等溫方程如式（8）所示。

式中：Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；Ce為吸附達到平衡時Nisin的質量濃度/（mg/mL）；KF為Freundlich模型下Nisin的最大吸附量/（mg/mg）；bF為Freundlich吸附平衡常數/（mg/（mg·min））。

Temkin吸附等溫方程如式（9）所示。

式中：Qe為吸附達到平衡時N i s i n的平衡吸附量/（mg/mg）；Ce為吸附達到平衡時Nisin的質量濃度/（mg/mL）；bT代表吸附強度/（J/mol）；AT為吸附平衡時的結合常數/（mg/mL）；R為理想氣體常數（8.314 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

1.3.2.4 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的熱力學分析

吸附熱力學可以探究吸附反應溫度對整個吸附過程的影響。熱力學參數的計算公式如式（10）、（11）所示[18]。

式中：KL為朗繆爾常數/（mL/mg）；ΔG°為標準吉布斯自由能變/（kJ/mol）；ΔH°為標準焓變/（kJ/mol）；ΔS°為標準熵變/（J/（mol·K））；R為理想氣體常數（8.314 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

1.4 數據分析

采用Origin 9.0軟件進行相關圖表的繪制以及模型的擬合。

2 結果與分析

2.1 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附動力學分析結果

多巴胺磁性納米粒子在不同溫度條件下吸附Nisin的動力學曲線如圖1所示。隨著吸附時間的延長，磁性納米粒子對Nisin的吸附量不斷增加。吸附反應在前5 min時反應速率較高，5 min后吸附速率增長緩慢。這是因為隨著吸附反應的進行，多巴胺磁性納米粒子的吸附位點逐漸減少，導致Nisin的吸附速率逐漸降低，直至達到吸附平衡。在298、318、338 K的溫度下，多巴胺磁性納米粒子的最大吸附量分別為0.421 4、0.407 7、0.494 9 mg/mg。

圖1 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的動力學曲線Fig. 1 Adsorption kinetics of nisin on IONPs@pDA at different temperatures

圖2 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的動力學方程擬合曲線Fig. 2 Linear kinetic plots of nisin adsorption onto IONPs@pDA at different temperatures

吸附動力學研究通過線性方程的擬合，計算吸附過程中吸附質在固液界面上的吸附速率等重要參數[19]，了解吸附機理和吸附本質。本研究選擇了4 種吸附動力學方程對吸附動力學過程進行擬合，結果如圖2所示。

表1 Lagergren準一級、準二級吸附動力學方程的吸附速率常數、理論及實際平衡吸附量Table 1 Pseudo-first-order and pseudo-second-order adsorption rate constants as well as calculated and experimental Qe values

由表1可知，Lagergren準二級動力學方程的R2最高，理論吸附量與實際吸附量更接近。因此，多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程更加符合Lagergren準二級吸附動力學模型，吸附速率由吸附劑表面未被占用的吸附空位數目的平方值決定。多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附受化學吸附控制，且化學吸附占主導作用，吸附過程涉及吸附質與吸附劑間的電子共享或電子轉移[20-21]。類似地，磁性鋅鐵氧體-海藻酸生物高分子復合材料對染料的吸附[22]、聚噻吩磁性納米粒子吸附瀝青[23]和磁性納米粒子從水中吸附堿性藍[24]的過程都符合Lagergren準二級吸附動力學模型，說明許多磁性納米粒子對蛋白和染料等物質的吸附過程并非是簡單的物理吸附，而主要受化學吸附控制。

表2 Elovich方程和內部擴散方程基本參數及相關系數Table 2 Basic parameters and correlation coefficients calculated for Elovich and pore diffusion equations

Elovich模型一般用于模擬吸附速率，隨著吸附溫度的增加，初始速率常數α也會增大，因此實驗中可以通過提高吸附溫度來增加初始反應速率。如表2所示，通過比較R2發現，Elovich模型較內部擴散模型能更好地解釋吸附過程，說明吸附反應速率和外部的不均勻擴散共同影響吸附過程[25]。如果內部擴散模型擬合結果是線性的，說明顆粒內擴散參與了吸附過程；如果擬合線經過原點，則說明顆粒內擴散是吸附反應的限速步驟。由圖2d可知，內部擴散模型的3條擬合線均沒有經過原點，說明內部擴散模型不能準確反映Nisin的吸附過程，且顆粒內擴散并不是Nisin吸附過程中的主要限速步驟[26]。

2.2 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附等溫線分析結果

圖3 多巴胺磁性納米粒子在不同溫度下對Nisin的吸附等溫線Fig. 3 Adsorption isotherms of nisin onto IONPs@pDA with different temperatures

如圖3所示，隨著Nisin平衡質量濃度（Ce）的增加，平衡吸附量（Qe）也在不斷增加。當Nisin平衡質量濃度增加到一定程度時，平衡吸附量增加緩慢或者不再變化，這是因為多巴胺磁性納米粒子吸附位點有限，導致吸附量不再隨著質量濃度的增加而增大。另外，由圖3可知，平衡吸附量隨著溫度的升高而增大，表明多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程是吸熱反應。

吸附等溫線描述了特定溫度下吸附質從液體介質到固體吸附劑的遷移過程[27]。本研究選擇了3 種吸附等溫方程，分別是Langmuir吸附等溫方程、Freundlich吸附等溫方程和Temkin吸附等溫方程，對吸附等溫線進行線性擬合，結果見圖4a、b、c。依據擬合結果，得到擬合直線的斜率和截距，分別計算獲得3 種模型常數（表3）。根據朗繆爾吸附等溫模型計算相應溫度下的分離系數RL，結果見圖4d。

圖4 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的熱力學方程擬合曲線Fig. 4 Linear thermodynamic plots of nisin adsorption onto IONPs@pDA

表3 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附等溫模型常數Table 3 Isotherm constants for adsorption of nisin by IONPs@pDA

Langmuir吸附等溫方程是一個經驗方程，它假設吸附是單層且均勻的過程，即反應具有恒定的焓和吸附活化能，用來描述吸附劑表面均勻時的吸附過程[28]。對于Langmuir吸附模型，KL能反映多巴胺磁性納米粒子結合Nisin的穩定性，實驗中KL隨著溫度的升高而增大，說明溫度的升高提高了多巴胺磁性納米粒子-Nisin耦合體的穩定性，更有利于吸附反應的進行。通過KL計算吸附反應的分離系數RL，根據RL可以判斷吸附反應過程的難易程度（RL＞1，反應不易進行；RL=1，線性反應；0＜RL＜1，反應較易進行；RL=0，反應不可逆）[28]。如圖4d所示，3 個溫度下的RL均在0～1之間，代表吸附反應過程容易進行。Freundlich吸附等溫模型是一個經驗模型，用來描述吸附劑的多分子層不均勻吸附過程[29]。Freundlich模型中KF代表吸附劑的吸附能力，bF用來描述吸附發生的難易程度（bF＞1，反應不易進行；bF=1，反應不可逆；0＜bF＜1，反應較易進行）[30]。本研究中KF隨溫度的升高而增大，表明溫度的升高提高了吸附劑的吸附能力，再次證明吸附過程是一個吸熱反應。而bF均小于1且隨溫度的升高而降低，表明溫度的升高使吸附反應越來越容易進行。Temkin吸附等溫模型用于研究非勻質表面能系統中吸附劑與吸附質之間的相互作用[31]。AT是達到吸附平衡時的結合常數，隨著溫度的升高，AT逐漸增大，表明隨溫度的升高，多巴胺磁性納米粒子與Nisin的結合作用逐漸增強。

通過比較表3中3 種模型的R2發現，Freundlich模型能夠更好地描述多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程。說明本研究制備的多巴胺磁性納米顆粒表面存在不均勻的吸附位點，并不是單一的單層、均勻吸附，反應是由各種相互作用引起的發生在吸附劑表面的多層不均勻吸附過程。吸附過程符合Freundlich模型的還有磁性海藻酸鹽/氧化碳納米管復合材料吸附陽離子染料[32]、殼聚糖磁性微球吸附結晶紫[33]和多羧酸多巴胺磁性微球吸附孔雀石綠染料[34]，這些研究結果表明，磁性納米顆粒經過表面修飾后，表面作用位點分布不均勻，進而產生了多層不均勻吸附的現象。

2.3 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附熱力學分析結果

通過熱力學結果分析能夠判斷吸附反應的自發性，了解吸附過程的難易情況[35]。根據公式（10）、（11）計算標準吉布斯自由能變（ΔG°）、標準焓變（ΔH°）和標準熵變（ΔS°）。如表4所示，298 K和318 K下吸附反應的ΔG°為正值，說明溫度較低時，吸附反應不能自發進行，但是當溫度為338 K時ΔG°為負值，說明反應可以自發進行。此外，吸附反應的ΔH°大于零，再次證明吸附過程是吸熱反應，升高溫度有利于吸附反應的進行，這與

2.2 節中吸附等溫模型研究結果一致。而吸附反應的ΔS°大于零，表明吸附反應是一個熵增加過程，吸附過程中固液界面的混亂度增大。

表4 不同溫度條件下多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附熱力學和活化能參數Table 4 Thermodynamic parameters and activation energy for the adsorption of nisin onto IONPs@pDA

3 結 論

本實驗研究了多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附理論。吸附動力學與吸附等溫線擬合結果表明，Lagergren準二級吸附動力學模型和Freundlich吸附等溫模型能更好地描述吸附過程，說明多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附主要受化學吸附控制，且吸附反應是發生在異構表面的多層不均勻吸附。熱力學分析結果表明多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程是吸熱反應，Nisin的吸附量隨著溫度的升高而增大。說明多巴胺磁性納米粒子能夠有效地吸附Nisin。本研究結果為獲得既保留Nisin抗菌活性又能夠快速磁分離防止細菌耐藥性產生的多巴胺磁性納米粒子-Nisin耦合體提供了理論依據。