原料乳體細胞數對硬質干酪蛋白水解及風味與質構品質的影響

穆 碩，劉鑫宇，羅 潔，任發政，李 博，王 娜，張永祥，葛克山,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，教育部北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083；2.河北省畜產食品工程技術中心，河北 三河 065200）

硬質干酪是向原料乳（牛乳、羊乳、水牛乳等）中添加發酵劑、凝乳酶之后，經發酵、排乳清、鹽搓、壓榨、成熟等工藝制作而成的一種干酪，因其獨特的質地風味與極高的營養價值而深受消費者的喜愛[1]。風味是影響消費者選擇干酪的重要因素，干酪中的風味物質主要在干酪的成熟過程中通過糖酵解、脂肪分解和蛋白質水解產生。蛋白質水解包括蛋白質降解為游離氨基酸和游離氨基酸降解為風味物質兩步，參與該過程的酶主要有3 個來源：天然存在于牛乳中的蛋白酶、微生物來源的內源性蛋白酶和添加的外源性蛋白酶。

在中國，自由放養和小規模奶牛養殖仍占有一定比例[2]，在這些養殖場中手動擠奶的方式會使體細胞混入原料奶中，包括上皮細胞、巨噬細胞、多核中性粒細胞（polymorphonuclears，PMNs）以及淋巴細胞[3]。在健康的牛乳中，巨噬細胞占35%～79%[4-5]、PMNs占3%～26%[6]、淋巴細胞約占16%～28%[7]，上皮細胞隨著泌乳過程從乳腺脫落進入牛乳當中，在健康牛乳中的數量較低，有時不能被檢測出來[3]。體細胞組成及數量對干酪品質具有重要影響。

關于體細胞數（somatic cell count，SCC）對干酪品質的影響已有大量研究，已有的研究結果表明，在全脂干酪體系下，高SCC會對硬質干酪造成游離脂肪酸增加、產生腐臭和脂肪氧化的味道、降低感官評分等不利影響[8-12]，但他們只關注了原料乳中體細胞的數量而并未解析體細胞組成，這些研究結合感官評價結果和游離脂肪酸測定結果，認為體細胞對脂肪降解的影響主導著干酪的感官評分，但他們并未測定干酪的揮發性風味物質變化。事實上蛋白質的水解也是風味形成的一個重要過程，鮮有研究在脫脂干酪體系下排除脂肪的干擾，單獨探討體細胞主導的蛋白水解對干酪風味物質的影響。

本研究采集了3 種不同SCC牛乳，解析其體細胞組成，并將其制作成脫脂契達干酪，通過測定干酪在成熟期的蛋白酶活力、蛋白水解程度及成熟后的揮發性風味物質含量和質構特性來探究SCC通過蛋白水解對干酪品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳選用正常乳和隱形乳房炎乳，取自河北福成奶牛場，原料乳均從工廠中的鮮奶貯藏罐取樣以排除奶牛個體間差異。

Mouse Anti Bovine CD11b（FITC）、Mouse Anti Bovine CD14（FITC） 美國Bio-Rad公司；Anti-Cytokeratin 18 Antibody（FITC） 英國Abcam公司；CD5 Antibody（Alexa Flour 488） 美國Nouvus Biologicals公司；R704直投式發酵劑、Stamix 1150凝乳酶 中國科漢森公司。

1.2 儀器與設備

Fossmatic5000體細胞檢測儀 丹麥FOSS公司；FACS AriaIII流式細胞儀 美國BD Biosciences公司；氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography/mass spectrometer，GC-MS）儀（配有電子轟擊離子源及MassHunter數據處理分析系統） 美國Agilent公司；固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）頭（50/30 μm DVB/CAR/PDM）、DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國色譜科公司；TMS-Pro型質構儀 美國FTC公司；AR2000型流變儀美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 原料乳制備

原料乳在3 000×g、4 ℃條件下離心15 min脫去脂肪，收集下層，并將沉淀在離心瓶底部的體細胞刮下復添回原料乳中，使用Fossmatic 5000體細胞檢測儀測定原料乳組分及SCC[13]。

1.3.2 原料乳體細胞組成測定

參考Rivas等[14]的方法，使用FACS AriaIII流式細胞儀測定原料乳中體細胞組成，使用Mouse Anti Bovine CD11b（FITC）標記PMNs[15]；使用Mouse Anti Bovine CD14（FITC）標記巨噬細胞[16]；使用Anti-Cytokeratin 18 Antibody（FITC）標記上皮細胞[17]；使用CD5 Antibody（Alexa Flour 488）標記淋巴細胞[18]。

1.3.3 契達干酪制作與指標的測定

使用質量分數為0.1%的直投式發酵劑和質量分數為0.05%的凝乳酶，參考Hu Ya’nan等[19]的方法進行干酪的制作。干酪在4 ℃條件下成熟90 d，并取成熟0 d的干酪進行水分、蛋白質量分數的測定[20]，成熟期間取0、15、30、60、90 d的樣品進行各項指標的測定。

1.3.4 總蛋白酶活力的測定

選取成熟0、15、30、60、90 d的干酪，準確稱取1.0 g，使用10 mL 20 g/L pH 7.0的檸檬酸三鈉緩沖液進行溶解。混勻后，于37 ℃水浴中保溫30 min。2 000×g離心5 min后取上清液按GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[21]進行測定。

1.3.5 蛋白水解程度

1.3.5.1 可溶性氮比例的測定

選取成熟0、15、30、60、90 d的干酪進行可溶性氮（soluble nitrogen，SN）的測定。參考Andrews等[22]的方法進行pH 4.6可溶性氮（pH 4.6-SN）的測定，結果以其在總氮中的占比（pH 4.6-SN/TN）表示；參考Brandsma等[23]的方法進行質量分數12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性氮的測定（12% TCA-SN），結果以其在總氮中的占比（12% TCA-SN/TN）表示。

1.3.5.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

取成熟0、15、30、60、90 d的干酪進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）實驗。參考Laemmli[24]的方法，取0.75 g干酪于研缽，加25 mL pH 4.6醋酸緩沖液研磨成漿狀，40 ℃保持1 h。經4 ℃、3 000×g離心30 min后取沉淀加6 mol/L尿素溶解并用BCA蛋白濃度法[25]測定蛋白質量濃度，最終將質量濃度調至1 μg/μL，并用5 倍體積的上樣緩沖液（pH 6.8，60 mmol/L Tris-HCl溶液、250 g丙三醇、20 g SDS、50 mLβ-巰基乙醇）稀釋后煮沸5 min，冷卻備用。SDS-PAGE實驗條件為：分離膠和濃縮膠分別為質量分數12%和質量分數6%的丙烯酰胺，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，凝膠經掃描儀掃描成像并用Quantity One軟件進行蛋白分子定性與定量分析。

1.3.6 干酪風味的測定

參考Pinho等[26]的方法采用頂空-SPME與GC-MS技術（headspace-SPME-GC/MS，HS-SPME-GC/MS）測定干酪成熟90 d后的風味物質。取10 g干酪于研缽，加等量的無水硫酸鈉研磨至粉末，迅速放入50 mL頂空瓶中并封蓋，于40 ℃水浴中平衡30 min。插入SPME頭，推出后于40 ℃水浴中吸附30 min，萃取頭首次使用前需260 ℃老化1 h，之后每次使用前230 ℃老化10 min。完成吸附后縮回SPME頭，進行GC-MS實驗。GC條件：色譜柱為DBWAX；載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度230 ℃，解吸附（溶劑延遲）時間3 min；升溫程序：起始溫度40 ℃，以3 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持2 min。MS條件：離子化模式為電子轟擊；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z35～600。

1.3.7 干酪品質的測定

1.3.7.1 質構特性的測定

取成熟0、15、30、60、90 d的干酪進行質構實驗，參考Hu Ya’nan等[19]的方法，使用TMS-Pro型質構儀對不同成熟期的干酪進行質構實驗。樣品先在室溫至少放置1 h以平衡溫度，再切成邊長為1.5 cm的正方體進行實驗，壓縮形變量為樣品高度的1/3。

1.3.7.2 流變特性的測定

取成熟90 d的干酪進行流變實驗，參考Brickley等[27]的方法，使用AR2000型流變儀對不同成熟期的干酪進行流變實驗。樣品先在室溫至少放置1 h以平衡溫度，選用直徑20 mm的鋁制探頭，調整間隙為2 mm，升溫范圍20～80 ℃，升溫速度3 ℃/min。

1.4 數據統計與分析

每組實驗均重復3 次并取平均值。實驗數據采用Excel軟件整理和制圖，SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，各表中數值以表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 原料乳成分與體細胞組成

表1 原料乳成分與體細胞組成Table 1 Chemical composition and somatic cell composition of raw milk

原料乳中成分及體細胞組成受很多方面因素的影響，如年齡和泌乳階段、季節、應激、奶牛管理水平等[16]。本實驗將收集到的原料乳按照SCC從多到少依次分為A、B、C 3 組，其成分及體細胞組成如表1所示。3 組脫脂乳的蛋白和乳糖質量分數沒有顯著差異（P＞0.05）。但體細胞組成有顯著差異，其中A組和B組的SCC分別為（4.03±0.60）×104個/mL和（29.30±0.70）×104個/mL；巨噬細胞是最主要的體細胞，A組和B組分別占（75.19±1.32）%和（66.22±1.27）%，這與前人的研究結果[4,14]一致；而C組的SCC顯著高于A、B兩組（P＜0.05），達（86.40±1.50）×104個/mL，且PMNs和上皮細胞的占比較A、B兩組顯著提高，分別為（38.81±0.84）%和（6.46±0.23）%。當有異物入侵乳腺或發生乳房炎時，乳腺的PMNs會大量增殖，淋巴細胞也會遷移到乳腺，導致乳中的體細胞增加，而且在乳房炎發生時，更多的上皮細胞會脫落并進入到乳中[28]。

2.2 成熟0 d的干酪組分

成熟0 d的脫脂契達干酪組分如表2所示，不同組干酪的蛋白質、水分質量分數沒有顯著性差異（P＞0.05），說明SCC對干酪組分沒有影響。

表2 脫脂契達干酪組分（成熟0 d）Table 2 Compositions of defatted Cheddar cheese after 0 d of ripening

2.3 體細胞組成對總蛋白酶活力的影響

在大多數干酪中，蛋白質水解是成熟過程中最復雜，也是最重要的反應。凝乳酶、血纖維蛋白溶酶和微生物來源的蛋白酶水解蛋白質生成短肽、氨基酸的混合物，直接改變干酪的風味與質構[29]。在本實驗中，影響總蛋白酶活力的因素有：凝乳酶殘留、發酵劑、體細胞、外源微生物（非發酵劑）。由1.3.3節的干酪制作工藝和2.1節的原料乳成分可知，凝乳酶和發酵劑的添加量是一樣的，且各組原料乳的菌落總數無顯著差異，因此可認定不同組間總蛋白酶活力差異是由體細胞造成的。原料乳體細胞中也含有多種蛋白質水解酶，最主要的有組織蛋白酶D、B、彈性蛋白酶和血纖維蛋白溶酶酶原[15,22]。體細胞會在加工及貯藏過程中破裂，其胞內蛋白酶釋放后會影響干酪成熟時蛋白質水解，進而對干酪的質構特性及風味產生影響。不同SCC原料乳制作的干酪總蛋白酶活力在貯藏期的變化如圖1所示，3 組干酪的總蛋白酶活力在貯藏期均有明顯的上升，且干酪中SCC越高，蛋白酶活力也越高（也包括外源污染微生物釋放的蛋白酶，即SCC越高，一般微生物菌落總數也越高）。其中，C組的蛋白酶活力在貯藏期結束時遠高于A、B兩組，這一方面是由于C組有較高的SCC，有更多的細胞破裂釋放更多胞內蛋白酶；另一方面，C組含有更高比例的PMNs，Luo Jie等[20]曾報道較高PMNs比例的原料乳制得的干酪具有更高的血纖維蛋白溶酶活性。

圖1 不同體細胞組成對脫脂契達干酪蛋白酶活力的影響Fig. 1 Effect of somatic cell composition on total protease activity during cheese ripening

2.4 體細胞組成對蛋白質水解的影響

不同體細胞組成干酪成熟過程中蛋白質的SDS-PAGE圖如圖2所示。在干酪成熟過程中，α-酪蛋白和β-酪蛋白水解較為明顯，且αs2-酪蛋白的水解尤為顯著，而β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的水解不明顯，這與前人的研究結果[23,30]一致。Quantity One分析結果顯示，干酪成熟90 d時C組αs2-酪蛋白（3 265±56）和β-酪蛋白（12 335±53）的灰度顯著小于A、B組（A組αs2-酪蛋白灰度為11 357±78、β-酪蛋白灰度為15 893±45；B組αs2-酪蛋白灰度為3 8 2 9±3 2、β-酪蛋白灰度為14 399±38）（P＜0.05），說明C組的蛋白水解作用最強，這與C組的體細胞組成有關。有研究指出，αs2-酪蛋白對于凝乳酶有較好的抵抗能力，血纖維蛋白溶酶是其主要的水解酶[31]；β-酪蛋白可以被凝乳酶和血纖維蛋白溶酶水解，其中血纖維蛋白溶酶起著非常重要的作用[32]。C組的體細胞組成中有著較高比例的PMNs以及較高的血纖維蛋白溶酶活性，所以使αs2-酪蛋白和β-酪蛋白得到較大程度的水解。

圖2 不同體細胞組成脫脂契達干酪成熟過程中蛋白質水解情況Fig. 2 Effect of somatic cell composition on proteolysis during cheese ripening

可溶性氮比例是評價干酪成熟度的重要指標，當干酪蛋白質發生二級降解時，干酪中的可溶性氮含量增加。pH 4.6可溶性氮是由殘留凝乳酶降解酪蛋白產生，被認為是“成熟廣度”的標志[33]。12% TCA可溶性氮是由發酵劑菌株和乳中內在微生物對酪蛋白作用產生，通常含有更多的小分子肽，被認為是干酪“成熟深度”的標志[33]。體細胞組成對干酪成熟過程中可溶性氮比例的影響如圖3所示。干酪的成熟廣度和深度都受體細胞影響，在成熟過程中，3 組干酪的12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN都呈現上升的趨勢，且SCC越高，12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN上升越快；C組干酪因其高SCC及高比例PMNs而使12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN明顯高于其他兩組（P＜0.05）。

圖3 體細胞組成對脫脂契達干酪成熟過程中可溶性氮比例的影響Fig. 3 Effect of somatic cell composition on soluble nitrogen ratio during cheese ripening

2.5 體細胞組成對干酪揮發性風味物質含量的影響

揮發性風味物質對干酪的感官特性具有重要的影響，其可在食用前被嗅聞，也可在干酪的食用過程中，在口腔溫度的加熱下從干酪中揮發出來并被人體感知從而產生感官體驗。揮發性風味物質的形成與干酪中蛋白質的水解有很大的關系。如表3所示，A組檢測到的揮發性風味物質最少，共20 種，其中包含醇類9 種、酯類2 種、醛類3 種、酮類4 種；B組檢測到24 種揮發性風味物質，其中包含醇類10 種、酯類3 種、醛類6 種、酮類4 種；C組檢測到的揮發性風味物質最多，有35 種，其中包含醇類12 種、酯類6 種、醛類8 種、酮類7 種。檢測到的揮發性風味物質越多表示成熟程度越高，這種趨勢也與2.4節中3 組干酪的12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN的結果一致。

乙醇是葡萄糖分解和氨基酸分解代謝中常見的終產物，在3 組干酪測得的醇類中，A組以乙醇為主，這與Arora等[34]用正常牛乳進行實驗獲得的結果一致；B、C兩組的乙醇含量減少，且醇的種類增加；C組的正己醇含量顯著高于A、B兩組，正己醇具有未成熟果實的青澀味，這種味道被認為是干酪中的不良風味并且與干酪蛋白的過分水解有關。

酯類、酸類和烷類物質在3 組干酪中的含量均很低，這是因為它們的生成與脂肪代謝相關，而實驗所用的脫脂乳中脂肪很少甚至沒有，因此與脂肪代謝相關的風味物質含量普遍較低。干酪中的醛類和酮類通常帶有香氣特征，對干酪的風味有很大的貢獻。3-羥基-2-丁酮具有奶油味，是乳制品中常見的特征風味物質之一，其通過檸檬酸鹽代謝途徑經雙乙酰還原生成，3 組干酪中的3-羥基-2-丁酮含量均最高，且B組的含量（（34.57±1.56）%）較其他兩組更高；辛醛、壬醛和2-壬酮具有未成熟果實的青澀味和脂肪酸敗味，葵醛具有肥皂味和花香味，以上物質在C組中的含量顯著高于A、B兩組（P＜0.05），且C組干酪中也檢測到少量具有肥皂味的仲辛酮（（0.31±0.01）%）和大量具有未成熟果實的青澀氣味的己醛（（6.38±0.56）%），這些物質的產生與蛋白質過分水解有關，且對干酪風味具有負面影響，這也與2.4節中C組蛋白質水解程度最高的結果一致。以上結果說明B組較高的SCC可以增加干酪特征風味物質的含量，但C組過高的SCC以及高蛋白水解程度會導致辛醛、壬醛、2-壬酮和癸醛等對干酪的風味有負面影響物質的產生。

表3 不同體細胞組成對脫脂契達干酪中的揮發性風味化合物相對含量的影響Table 3 Effect of somatic cell composition on volatile components in cheese

2.6 體細胞組成對干酪的質構和流變特性的影響

圖4 不同體細胞組成對脫脂契達干酪質構和流變特性的影響Fig. 4 Effect of somatic cell composition on textural and rheological properties of cheese

本實驗通過測定90 d成熟過程中干酪的硬度和彈性變化來反映不同SCC與組成對干酪質構品質的影響，結果如圖4所示。在成熟過程中，3 組干酪的硬度均有下降的趨勢，且A組干酪的硬度顯著高于B、C兩組（P＜0.05）；3 組干酪的彈性無論是在組間還是在成熟過程中均沒有出現顯著差異。硬度反映了干酪中保持形狀的內部結合力，由2.4節結果可知，B、C兩組干酪在成熟過程中αs2-酪蛋白被降解的程度較高，這會減小干酪內部酪蛋白的結合力，從而導致硬度減小。αs1-酪蛋白是蛋白網絡結構的基石，干酪的彈性與干酪中完整αs1-酪蛋白的結構密切相關，其降解會削弱酪蛋白網絡結構，進而影響干酪的彈性[35]。3 組干酪的彈性在成熟期沒有出現顯著差異，說明αs1-酪蛋白網絡結構在成熟期基本沒有改變，這也與2.4節中αs1-酪蛋白被降解程度低的結果一致。

本研究選用成熟90 d的干酪進行不同體細胞組成對干酪流變特性影響的研究，結果如圖4c所示。干酪的儲能模量（G'）會隨溫度升高而減小，這與酪蛋白分子間的作用力有關，當加熱時酪蛋白間氫鍵作用力降低，進而導致G'的減小，增加干酪的黏性。當溫度小于50 ℃時，在相同溫度下，A組的G'最高，C組的G'最低。低G'表明凝膠網絡結構中化學鍵的數量較少或強度較低，凝膠結構更容易被破壞。C組的高SCC及高蛋白酶活性會促進酪蛋白水解，進而使C組干酪的酪蛋白凝膠強度降低，G'降低。

3 結 論

本實驗選用不同SCC的原料乳制作脫脂契達干酪，研究了不同SCC及組成干酪的蛋白質水解程度及其對干酪風味和品質的影響，結果表明較高SCC可提升干酪特征風味物質3-羥基-2-丁酮的含量，但過高SCC會因其高比例PMNs和高αs2酪蛋白水解活力而降低干酪硬度，增加不良風味物質的種類與含量。本研究為原料乳及干酪產品質量控制提供了理論依據。