薰衣草精油微乳體系的相行為、微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和清除自由基活性

宋曉秋，王麗萍，孫 月，李帥濤，張 芊，葉 琳，楊曉波，王一非*

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

隨著國(guó)家越來越嚴(yán)格地限制使用各類化學(xué)合成添加劑，食品行業(yè)對(duì)天然生物活性物質(zhì)的需求日趨增加。植物精油作為提取自芳香植物的次生代謝產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1]。其中，薰衣草精油具有鎮(zhèn)靜安神、抗氧化、抗菌、抗炎癥和止痛等多種生物活性[2]。但是，精油具有疏水性質(zhì)，限制了其在食品中的應(yīng)用[3]，因此需要發(fā)展一種有效的載運(yùn)體系，以提升薰衣草精油的使用性能。

微乳液是一種由一定配比的表面活性劑、助表面活性劑、水和油自發(fā)形成的各向同性、外觀透明或半透明、熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系，具有提高油性物質(zhì)親水性和抗氧化性的作用[4]。對(duì)單相微乳液而言，根據(jù)油或者水作為分散相的情況，將微乳液劃分為O/W型、W/O型和雙連續(xù)型3 種[5]。近期研究顯示，微乳體系對(duì)活性物質(zhì)的保護(hù)作用與相行為有一定關(guān)聯(lián)。Deng Lingli等[6]發(fā)現(xiàn)百里香酚微乳液從W/O到雙連續(xù)再到O/W型的過程中，隨著水相的增加，抗氧化性提升而抑菌性下降。同時(shí)，植物精油微乳液的清除自由基活性與體系中的表面活性劑、助表面活性劑濃度有關(guān)。Kim等[7]發(fā)現(xiàn)在茶樹精油微乳液中，蔗糖月桂酸酯為表面活性劑和丙二醇為助表面活性劑的配方對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除起到負(fù)面作用。由此可見，微乳體系能夠?qū)崿F(xiàn)植物精油的增溶與增效，但需要進(jìn)一步深入研究其微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變與精油活性成分之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)以Tween-80作為非離子型表面活性劑，二丙二醇（dipropylene glycol，DPG）為助表面活性劑，構(gòu)建可以無限稀釋的薰衣草微乳體系；通過對(duì)染料擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和電導(dǎo)率及黏度的測(cè)定，分析其微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；通過對(duì)DPPH自由基和2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定，研究微乳結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變對(duì)抗氧化性能的影響，從而為植物精油微乳體系在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薰衣草精油（lavender essential oil，LO） 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十四師47團(tuán)；Tween-80、DPG、氯化鈉、蘇丹III、DPPH和乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

PL 403電子天平、手動(dòng)移液器（100 μL） 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DDB-303A電導(dǎo)率儀 上海電子科技儀器有限公司；DV-I布氏黏度計(jì) 美國(guó)博勒飛公司；JA-2003電子天平 上海天龍儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微乳體系的構(gòu)建

采用滴水法，將油相（m（薰衣草精油）∶m（DPG）=1∶1）和表面活性劑（Tween-80）按照一定質(zhì)量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）混合，水浴振蕩至均勻后，間隔滴加蒸餾水，振蕩，待其恢復(fù)澄清透明狀態(tài)，渾濁時(shí)停止加水并記錄加水總量。按照臨界點(diǎn)油相、表面活性劑相和水相所占比例，借助Origin Pro 9.1軟件繪制出對(duì)應(yīng)的三元相圖，通過三元相圖能夠較為直觀地了解助表面活性劑對(duì)（微乳區(qū)）面積的影響[8]，從而確定微乳單相區(qū)，計(jì)算出微乳單相區(qū)占三元相圖總面積的比例。

1.3.2 微乳體系微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

染色法：選取油溶性染料蘇丹III（1.0 g/L），分別等量滴加于水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同的微乳液試管中，輕微搖晃，觀察顏色的擴(kuò)散現(xiàn)象[9]。

電導(dǎo)率法：在體系中添加少量的NaCl（0.01 mol/L）作為電解質(zhì)[10]，于25 ℃條件下進(jìn)行電導(dǎo)率的測(cè)定。電解質(zhì)在體系中跟隨水相流動(dòng)，因此能夠間接反映水相的行為變化。

黏度的測(cè)定：測(cè)試采用LV-01（61）轉(zhuǎn)子，所有樣品均以固定的轉(zhuǎn)速5 r/min進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果單位用cP表示[11]。

1.3.3 微乳體系抗氧化能力測(cè)定

DPPH自由基清除率法：參考Deng Lingli[6]和Kim[7]等的方法測(cè)定DPPH自由基清除率，將2.0 mL微乳液與100 μL 2.0 mmol/L的DPPH乙醇溶液振蕩混合搖勻，25 ℃下靜置90 min（避光保存）。以等量（2.0 mL）乙醇代替微乳液作為空白。根據(jù)公式（1）計(jì)算DPPH自由基的清除率。

式中：Ab為空白溶液吸光度；As為測(cè)試樣品溶液吸光度。

使用ABTS試劑盒測(cè)定ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。將微乳液樣品（10 μL）與新鮮配制的ABTS溶液（200 μL），黑暗中孵化12～16 h后，將該混合物在25 ℃條件下振蕩10 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。根據(jù)公式（2）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率。

式中：Ab為空白溶液吸光度；As為測(cè)試樣品溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

理化指標(biāo)表征實(shí)驗(yàn)重復(fù)1 次，每次處理3 個(gè)平行。三元相圖采用Origin Pro 9.1軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPG對(duì)薰衣草微乳體系的增溶作用

圖1 薰衣草-DPG微乳體系在25 ℃時(shí)的三元相圖Fig. 1 Ternary phase diagrams of systems at 25 ℃

短鏈醇常作為助表面活性劑用于微乳體系的構(gòu)建[12]。本實(shí)驗(yàn)將DPG與薰衣草精油（1∶1，m/m）為油相構(gòu)建三元相圖，結(jié)果如圖1所示。圖1中的陰影區(qū)域代表渾濁區(qū)，白色區(qū)域代表單相區(qū)（即微乳液形成區(qū)域）。DPG作為助表面活性劑時(shí)，單相區(qū)面積（Am）由單一薰衣草精油微乳液時(shí)的34.1%增大到71.4%，對(duì)薰衣草精油微乳液具有明顯的增溶效果。影響表面活性劑界面行為的3 個(gè)因素是界面張力、自發(fā)曲率和彎曲剛度。在微乳液中，多元醇能夠降低油相和水相界面之間的界面張力[13-14]。在已報(bào)道的一些植物精油及其主要成分的非離子型微乳體系中，乙醇、1,2-丙二醇等常見短鏈醇作為助表面活性劑添加到油相中，油/醇質(zhì)量比為1∶1時(shí)，單相區(qū)面積一般在40%～50%范圍內(nèi)[6,15]。本研究發(fā)現(xiàn)DPG對(duì)薰衣草精油具有增溶作用。推測(cè)DPG的碳鏈長(zhǎng)度和羥基位置利于其嵌入界面改變基團(tuán)的極性，從而使界面膜自發(fā)曲率的發(fā)生更利于微乳液的形成[16]。因此，選擇薰衣草-DPG微乳體系無限稀釋線D82中水分體積分?jǐn)?shù)不同的體系，進(jìn)行后續(xù)微觀相行為轉(zhuǎn)變和抗氧化性研究。

2.2 微乳體系類型鑒定及微觀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變

通過觀察油溶性染料蘇丹III在不同水分體積分?jǐn)?shù)薰衣草-DPG微乳體系中的擴(kuò)散狀態(tài)，可以直觀判斷微乳液類型。當(dāng)蘇丹III在微乳液中擴(kuò)散非常均勻時(shí)，說明微乳液為W/O型；反之，若蘇丹III浮于微乳液表面，則說明其為O/W型；若狀態(tài)介于兩者之間，則為雙連續(xù)型微乳液[17]。

在無限稀釋線D82上分別取水分體積分?jǐn)?shù)為0%～90%的微乳體系進(jìn)行蘇丹III擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)油溶性染料能夠完全擴(kuò)散在水分體積分?jǐn)?shù)為0%～30%的微乳體系中（圖2），且完全不溶解于水分體積分?jǐn)?shù)為60%～90%的微乳體系。說明當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)為0%～30%時(shí)該薰衣草-DPG微乳體系為W/O型微乳體系，水分體積分?jǐn)?shù)在40%～50%之間為雙連續(xù)型，水分體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)其微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型。

電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果與染色法結(jié)果一致。隨著水分體積分?jǐn)?shù)增加，微乳體系的電導(dǎo)率變化總體呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)。當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)為0%～30%時(shí)，微乳液的電導(dǎo)率較小，這是由于水分子被反向膠束所束縛，分散于油相中，水分子之間不能相互作用，符合W/O型的特征[18]。當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，微乳體系結(jié)構(gòu)從W/O型轉(zhuǎn)變?yōu)殡p連續(xù)相，電導(dǎo)率的增幅最大。在該階段，反向膨脹的膠束被緩慢地扭曲，水分子變得更具有流動(dòng)性，在水分子液滴碰撞之間的流動(dòng)水通道產(chǎn)生滲流狀態(tài)，因此電導(dǎo)率增加最快[19]。當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，微乳體系結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W，電導(dǎo)率持續(xù)升高，說明更多的或全部水分子脫離了反向膠束的束縛，分子間相互碰撞也更加劇烈[20]。另外觀察到O/W階段電導(dǎo)率的增加速率略低于雙連續(xù)階段，可能與水分子流動(dòng)性的增加和純水稀釋效應(yīng)有關(guān)[7,21]。

圖2 不同水分體積分?jǐn)?shù)的微乳體系電導(dǎo)率Fig. 2 Electrical conductivity of microemulsion systems with different water contents

2.3 微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變對(duì)微乳體系黏度的影響

微乳液作為抗氧化復(fù)合載體應(yīng)用到具體產(chǎn)品中時(shí)，黏度是重要的物理參數(shù)。微乳液的宏觀黏度會(huì)受到微觀結(jié)構(gòu)的影響[22-23]。圖3為薰衣草-DPG微乳體系黏度變化趨勢(shì)，可以看出該體系是“鐘型”曲線[10,24]。在水分體積分?jǐn)?shù)0%～30%區(qū)間，黏度很低且變化小，這可能取決于W/O結(jié)構(gòu)[24]。當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)從40%增加到50%，黏度上升速率顯著加快。這一階段雙連續(xù)結(jié)構(gòu)形成，界面面積逐漸增加，界面之間相互作用也更加頻繁，水-油通道的聚集和相互連接在宏觀上表現(xiàn)為微乳體系黏度的不斷增加[25]。隨著水分體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，最大黏度出現(xiàn)在水分體積分?jǐn)?shù)為50%左右，正是微乳體系由雙連續(xù)相到O/W體系的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。Sharma等[26]的研究表明，六方相存在于水分體積分?jǐn)?shù)為30%～47%的水溶液中。Bonacucina等[27]研究了Tween-80/肉豆蔻酸異丙酯（9∶1，m/m）的微乳體系，當(dāng)體系水分體積分?jǐn)?shù)為20%～60%時(shí)，發(fā)現(xiàn)有類似凝膠結(jié)構(gòu)的形成。由此推測(cè)，薰衣草-DPG微乳體系中雙連續(xù)相高黏度現(xiàn)象可能是六方相或棒狀結(jié)構(gòu)膠束的形成所導(dǎo)致的，此時(shí)形成的膠束體積和單個(gè)膠束表面積均較大，導(dǎo)致膠束之間相互作用面積及相互作用力更大。當(dāng)進(jìn)一步提高體系的水分體積分?jǐn)?shù)使其轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型時(shí)，常規(guī)球狀膠束形成，破壞了棒狀或者六方相結(jié)構(gòu)的膠束結(jié)構(gòu)，降低了膠束之間的相互作用以及它們之間相互碰撞的概率，從而出現(xiàn)黏度急劇下降的現(xiàn)象[6]。

圖3 不同水分體積分?jǐn)?shù)的微乳體系黏度變化Fig. 3 Viscosity change of microemulsion systems with different water contents

2.4 微乳體系微觀結(jié)構(gòu)對(duì)自由基清除能力的影響

2.4.1 DPPH自由基清除活性

圖4 不同水分體積分?jǐn)?shù)的微乳體系DPPH自由基清除率Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of microemulsion systems with different water contents

DPPH自由基清除能力常作為檢測(cè)物質(zhì)抗氧化活性的指標(biāo)。由圖4可知，當(dāng)微乳體系為W/O型和雙連續(xù)相時(shí)，隨著水分體積分?jǐn)?shù)的增加，D82微乳體系DPPH自由基清除率快速提高。當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)提高到50%時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到70%左右。但是，隨著水分體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，體系結(jié)構(gòu)由雙連續(xù)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W結(jié)構(gòu)，DPPH自由基清除率基本保持不變。

在薰衣草-DPG微乳體系D82的W/O階段，水相被油相所束縛，包埋在反向膠束內(nèi)，存在于體系中的多余表面活性劑膠束在反向膠束界面形成保護(hù)層，阻礙油相薰衣草油滴與DPPH自由基間的相互接觸和作用；因此隨著體系水分體積分?jǐn)?shù)的升高，反膠束流動(dòng)性提高，表現(xiàn)為DPPH自由基清除率快速提高。但是到了O/W階段，相同的反應(yīng)體積內(nèi)薰衣草精油含量進(jìn)一步降低，而DPPH自由基清除能力維持不變，這可能是隨著結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，逐步增加的自由水加速了自由基反應(yīng)所致[28]。

2.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)是可以同時(shí)評(píng)價(jià)脂溶性和水溶性物質(zhì)抗氧化活性的方法[29]。圖5反映了D82體系在734 nm波長(zhǎng)處ABTS陽(yáng)離子自由基脫色程度，即微乳液樣品的總抗氧化能力[30]。從圖5可以看出，當(dāng)水分體積分?jǐn)?shù)為0%～50%時(shí)，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率總體呈下降趨勢(shì)。說明當(dāng)微乳液在W/O型和雙連續(xù)型的階段，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除作用取決于精油的劑量[31]。在O/W型階段，ABTS自由基的清除率隨著水分體積分?jǐn)?shù)的增加發(fā)生明顯變化，在水分體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)出現(xiàn)峰值，清除率達(dá)63%，與水分體積分?jǐn)?shù)為0%的體系清除率基本相同。薰衣草精油的主要成分是芳樟醇、乙酸芳樟酯、1,8-桉葉油素、羅勒烯、萜烯醇和樟腦[32]。因而推測(cè)在體系轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型微乳后，釋放出的親水基團(tuán)迅速與ABTS陽(yáng)離子自由基進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)微乳體系水分體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加到80%～90%時(shí)，ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力迅速下降，這可能是同體積樣品中薰衣草精油含量降低造成的。綜合以上結(jié)果表明，微乳液微觀結(jié)構(gòu)和精油劑量對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性有明顯的影響。

圖5 不同水分體積分?jǐn)?shù)的微乳體系A(chǔ)BTS陽(yáng)離子自由基清除率Fig. 5 ABTS radical scavenging activity of microemulsion systems with different water contents

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用三元相圖，以薰衣草精油和DPG等質(zhì)量混合為油相，以Tween-80為表面活性劑，構(gòu)建了一個(gè)可以有效提高薰衣草親水性的多元微乳體系。以該體系微乳區(qū)域的一條無限稀釋線D82為研究對(duì)象，通過染料擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和電導(dǎo)率測(cè)定了其微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變及其對(duì)微乳體系黏度變化的影響規(guī)律。通過抗氧化性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在O/W型階段，雖然薰衣草精油含量低，但反應(yīng)界面面積大，呈現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除能力。ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力則在W/O型和雙連續(xù)型階段先下降，在進(jìn)入O/W型階段回升，并在水分體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)出現(xiàn)峰值，其受到精油含量與微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的雙重影響。本研究結(jié)果可能為油性功能性原料多元體系在食品中的應(yīng)用領(lǐng)域提供一定的理論支持。