添加益生元對酸乳凝膠過程及微觀結構的影響

王雅楠，韓育梅*，何 君

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

益生元是通過腸道內微生物的代謝作用和可選擇性地刺激腸道內微生物的增殖或活力，進而對宿主健康產生有益影響的非消化性成分[1-2]。益生元可根據組成、結構以及在酸乳中的應用分為低聚糖類和多糖類，低聚果糖和低聚半乳糖是低聚糖類益生元的代表，而菊粉屬于多糖類益生元[3]。菊粉和低聚果糖的結構均由葡萄糖和果糖構成，由于結構單元之間是通過β-葡萄糖苷鍵相連，因此人體攝入后不能被小腸消化吸收，但在結腸內可被有益微生物分解利用從而對人體健康有益[4-5]。低聚半乳糖是一種寡糖類混合物，其具有較高的熱穩定性和一定的抗消化性，同時可在結腸內被有益微生物有效吸收利用[6]。另外,它可在酸乳中對嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等有益菌進行有效的增殖保護作用[3]。目前已有研究表明，菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖等益生元對酸乳中的益生菌有一定的保護作用，從而通過延緩酸乳的后酸化現象和乳清析出等問題，改善酸乳品質[7-8]；還可被人體攝入產生益生元作用[9]。但這些研究多是從酸乳的黏度變化、乳清析出、活菌總數、感官評價等宏觀靜態方面來評價3 種益生元在酸乳中的應用情況，因此從酸乳凝膠結構的形成變化、乳液環境中顆粒大小及結構的變化等微觀動態角度進行研究分析具有重要意義[10]。Hemar等[11]利用擴散波光譜（diffusing-wave spectroscopy，DWS）方法與傳統流變學方法對比測定酪蛋白凝膠時間以及發酵過程中凝膠結構形成的動態變化，對比研究2 種方法所對應結果的差異性與統一性，從而得出DWS方法可有效監測發酵乳或奶酪的加工過程。杭鋒等[12]利用Turbiscan多重光散射法研究超高溫滅菌乳的穩定性，并采用穩定性動力學指數評價分析體系的穩定性。呂長鑫等[13]采用掃描電子顯微鏡和Turbiscan穩定分析儀結合分析紫蘇酸性乳飲料乳化穩定性，將微觀結構與穩定性進行關聯分析。

本實驗采用新的微觀研究方法分析菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖3 種益生元對酸乳凝膠過程及微觀結構的影響。主要通過無損害非接觸式的多重擴散波光譜（multi-speckle diffusing wave spectroscopy，MS-DWS）微觀黏度因子（micro viscosity indexes，MVI）、彈性因子（elasticity indexes，EI）和固液平衡（solid liquid balance，SLB）值作為流變學參數研究發酵過程中酸乳黏彈性等流變學特性，通過靜態多重光散射（static multiple lightscattering，SMLS）研究酸乳凝膠形成過程中顆粒的變化情況，以及掃描電子顯微鏡觀察酸乳的微觀結構，從而揭示和評價菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖對酸乳的作用效果和影響，對完善益生元等益生因子提高酸乳品質的工藝[14-15]具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚果糖 上海源葉生物科技有限公司；菊粉 美國國民淀粉化學公司；低聚半乳糖 山東保齡寶生物科技有限公司；全脂乳粉 新西蘭恒天然集團；酸乳直投式發酵劑YF-L812、雙歧桿菌BB-12（活菌數約為6×108CFU/g）丹麥科漢森股份有限公司；其他均為國產試劑分析純。

1.2 儀器與設備

Rheolaser Master型光學法微流變分析儀、TLAB AGS型Turbiscan穩定性分析儀 法國Formulaction儀器公司；SX-500蒸汽滅菌器 日本TOMY公司；Pro型掃描電子顯微鏡 復納科學儀器（上海）有限公司；PB-10型酸度計 德國賽多利斯儀器有限公司；超凈工作臺 蘇州凈化儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

根據GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》，按照工藝“牛乳→標準化→加入添加劑→均質→加熱殺菌→冷卻→加入發酵劑與益生菌→恒溫發酵→攪拌冷卻→后熟→保藏”制備酸乳。添加劑分別為1.5 g/100 mL的菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖。發酵劑選用YF-L812型酸乳直投式發酵劑（含德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜熱鏈球菌），益生菌為雙歧桿菌BB-12。發酵期（4.5 h）結束后，于4 ℃冰箱中保存至24 h[16]。

1.3.2 益生元對酸乳凝膠形成微觀結構的影響

參考Cui Bo[17]、Liu Juan[18]等的方法，將后熟結束后貯藏1 d的酸乳樣品均勻薄涂在培養皿內壁上，在液氮中冷凍后迅速放入真空冷凍干燥機中進行干燥處理，然后進行掃描電子顯微鏡制片，最后在10 kV電壓和放大5 000～6 000 倍下觀察和采集圖像 。

1.3.3 益生元對酸乳凝膠形成過程中微流變學參數的影響

參考Titapiccolo等[19]的方法利用光學微流變儀檢測酸乳發酵期（0～4.5 h）與后熟（4.5～24.0 h）后的凝膠體系穩定性。將20 mL發酵期樣品小心轉移至特制平底圓柱形帶塞玻璃瓶中，注意勿沾染在玻璃瓶璧上以免影響光學信號偏差；再將玻璃瓶迅速轉移至測定槽，于43 ℃下觀測凝膠過程中的MVI、EI以及SLB值隨時間的變化情況。每隔1 min采集1 次數據。發酵結束后，將玻璃瓶取出放入冷藏箱，于4 ℃條件下冷藏后熟至24 h，再將樣品放入測定槽中待樣品恢復室溫后繼續采集數據，并根據儀器自帶分析軟件獲取相關流變學參數，所有樣品重復測定3 次。

1.3.4 益生元對酸乳凝膠體系穩定性的影響

參考白潔[20]、呂長鑫[13]等的方法，使用穩定性分析測試儀采用850 nm近紅外光源監測探頭檢測酸乳發酵期（0～4.5 h）與后熟（4.5～24.0 h）后凝膠體系的穩定性。按照添加量分別制備含有1.5 g/100 mL菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖的酸乳，將樣品放入檢測器內，檢測器沿圓筒形樣品管上下移動，每40 μm掃描1 次獲得透射光與反射光強度，每20 s掃描1 次，管高度為40 mm，測定溫度為43 ℃，所有樣品重復測定3 次。最終由穩定性分析儀獲取的透射光強度變化（背散射光強度隨時間的變化以及穩定性指數）判斷凝膠體系穩定性。

1.4 數據處理

體系穩定性數據采用Turbiscan穩定分析儀自帶的Turbiscan Easysoft軟件進行分析；微流變數據采用Rheolaser Master型光學法微流變分析儀自帶的Smart軟件進行分析。所有圖表均采用Origin 9.4軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 益生元對酸乳凝膠形成微觀結構的影響

圖1 酸乳凝膠結構的掃描電子顯微鏡圖Fig. 1 Scanning electron micrographs of yogurts

酸乳微觀結構主要是由酪蛋白聚集形成的三維網狀結構所構成。由圖1可知，酪蛋白膠粒聚集形成的球狀結構清晰可見，膠粒之間存在絲狀物，這些絲狀物包含胞外多糖等大分子物質，此外酪蛋白膠粒之間的間隔處也通常由乳清與微生物菌體填充[21]。由于本實驗樣品前處理過程中采用真空冷凍干燥，推測乳酸菌菌體可能因爆裂而無法看見，網狀結構中會留下較多乳清液，因此其結構區別于其他溶劑干燥法所得產品中有一定的乳酸菌菌體存在于明顯的網狀空隙結構中[18,22]。

空白組與含有菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖的酸乳微觀結構存在明顯區別。空白組酸乳的微觀網狀結構中，酪蛋白膠粒之間呈現出大小不一的空隙，但整個酪蛋白網狀結構鋪滿觀察視野。以空白組酸乳微觀結構為對照，發現含有低聚果糖的酸乳微觀網狀結構形態較為緊密，其中酪蛋白膠粒之間的間隙較小，并且大小不一，同時存在較多網狀結構大小不一的碎塊，可能是酪蛋白在形成膠粒的過程中受到了不均勻的外力所致。此外，圖1中還發現表面光滑的白色塊狀物，部分與酪蛋白膠粒表現出一定程度的附著關系，可能是低聚果糖聚合物。含低聚半乳糖的酸乳微觀結構呈現出由不均勻致密小塊聚合而成的較為松散的結構，而含有菊粉的酸乳微觀結構更為平整，且網狀結構之間的間隙相比空白組酸

乳更為均勻。比較菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖三者對酸乳微觀結構的影響發現，菊粉使酸乳的微觀結構更為完整，酪蛋白膠粒之間的間隙更大。因此，菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖3 種益生元對酸乳凝膠形成的微觀結構影響不同，菊粉更有助于酸乳形成較為均勻、疏松的微觀結構。

2.2 益生元對酸乳凝膠形成過程中微流變學參數的影響

圖2 發酵及后熟期間酸乳的MVIFig. 2 Micro viscosity index of yogurts during fermentation and ripening

圖3 發酵及后熟期間酸乳的EIFig. 3 Elasticity index of yogurts during fermentation and ripening

圖4 發酵及后熟期間酸乳的SLB值Fig. 4 Solid-liquid balance values of yogurts during fermentation and ripening

由圖2～4可知，所有樣品的MVI、EI和SLB值變化趨勢相同，但不同樣品在發酵及后熟期間不同時間段的MVI、EI和SLB值也不同。

酸乳的加工過程包括發酵和后熟（通常為貯藏期）兩部分，且凝膠結構形成于發酵階段，而后熟期間也會伴隨著彈性與流變學狀態的變化。微流變主要根據乳液環境中微粒的運動與體積狀態分析其流變學性質。隨著發酵的進行環境中的酸度逐漸降低，使得乳液中原有的聚集體發生改變，酪蛋白顆粒聚集形成彼此間有空隙的結構，進而最終形成以酪蛋白膠粒為基礎的凝膠結構[23-24]。Titapiccolo等[19]的研究表明，均質牛乳酸凝膠形成初期的主要驅動力為酪蛋白膠束；在酸乳環境中，金屬鹽離子、乳酸菌代謝產物或添加劑等也會與酸度共同作用影響蛋白質凝膠的形成，酸乳凝膠的形成是乳中生物作用和物理作用的共同結果。MVI作為時間的函數可以直接反映黏性模量，即損耗模量在一定時間內的變化形成，其可以顯示酸乳黏度的變化[25-26]。由圖2可知，菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖及空白對照組酸乳的發酵是一個多級過程，發酵前2 h各樣品黏度無明顯變化，被稱為低黏度的初始停滯階段；發酵2 h后，樣品黏度呈迅速上升趨勢，酪蛋白膠粒解離，乳液中凝膠開始形成，從而進入黏度快速變化階段；之后，各酸乳樣品MVI迅速增加至最大值，進入高黏度階段[24]。高黏度階段使整個酸乳形成較為穩定的凝膠體系。其中菊粉酸乳和空白樣品的黏度在小范圍降低后又迅速回升，可能是因為形成的凝膠結構不穩定。最終樣品MVI的大小關系為低聚果糖酸乳＞低聚半乳糖酸乳＞菊粉酸乳＞空白酸乳。

EI作為時間的函數可以直接反應彈性模量，即儲能模量在一定時間內的變化形成[25-26]。由圖3可知，所有酸乳樣品的EI在發酵0～2.5 h內保持穩定，因為乳液中的酪蛋白尚未形成凝膠結構，但在此期間MVI和SLB值處于較大程度的波動狀態，且含有低聚果糖酸乳的彈性最高。當發酵2.5 h時，所有樣品的EI變化均出現拐點，即凝膠點，也是乳液體系開始凝膠的時間節點，并且時間較為接近，進一步驗證說明與空白樣相比益生元對酸乳凝膠的速率影響不大，一般而言酸乳的凝乳速率主要受溫度以及發酵劑菌種的影響。最終也是低聚果糖的EI最大。

SLB值與產品黏彈性對應成正比，直接表現了產品偏向固態或者液態的與時間對應的函數關系。由圖4可見，酸乳的SLB值變化范圍在0～0.5之間，表現出彈性模量，偏向于固態；若在0.5～1.0之間則表現出黏性模量，偏向于液態[25-26]。因此，整個發酵及貯藏期間含有低聚果糖的酸乳表現出較強的固體性質。

2.3 益生元對酸乳凝膠體系穩定性的影響

圖5 發酵及后熟期間不同酸乳樣品的背散射光強度Fig. 5 Back scattering light intensity of different yogurt samples during fermentation and ripening

由圖5可知，不同酸乳樣品在各時間段內背散射光強度相對于0 h(發酵起始階段)的對應樣品高度的變化情況。其中，參比值變大代表著對樣品高度的微粒吸收光強度變大且顆粒變大，反之則代表著吸收光強度變小且顆粒變小，背散射光強度參比變化越大說明體系越不穩定，正峰與負峰分別表示微粒出現較大程度地聚集或分散，這種沉淀或者澄清與肉眼觀察的沉淀與澄清不同，因為圖5中反映的是微觀粒子的變化情況，并且在宏觀上可能反映不明[12,26]。

在空白樣品中，背光散射光強度曲線反映的是典型酸乳加工過程中微粒聚散的變化，樣品底部出現小范圍的正峰，表示底部有較小程度的沉淀出現；樣品中間部位背散射光強度參比平行增加，這反映了酪蛋白一類大分子物質較為均勻地聚合，粒徑變大，形成較為穩定的凝膠網狀結構的過程；而樣品頂部的負峰則表示頂部澄清現象，即出現了乳清析出[13]。通過背散射光強度參比與時間的關系發現，所有樣品在后熟后出現不同程度的頂部澄清現象，這可能與后酸化和冷凍使得凝膠網狀結構壓縮以及蛋白質和淀粉等大分子物質持水力下降有關[27]。

含有菊粉的酸乳與空白樣品的背光散射光強度參比的變化較為相似，而含有低聚果糖酸乳的中間部位背散射光強度參比變化程度較大，說明相對于空白樣品而言，其形成的凝膠網絡結構中的微粒粒徑較大，結合圖1發現，低聚果糖使酸乳凝膠網狀結構更為緊密，并且對應的酪蛋白膠粒的粒徑也較大，因此低聚果糖在一定程度上也會對蛋白質的粒徑產生影響。另外，含有低聚半乳糖酸乳出現比空白樣品更大程度的頂部澄清，中間段的背散射光強度參比變化較為均勻，且平行變化的幅度與空白樣品較為相似，但是在頂端出現了較大程度的澄清和聚集現象，表明頂端乳清析出與脂肪上浮情況較嚴重。在含有菊粉酸乳的背光散射光強度曲線中可以發現，酸乳底部沉淀現象較弱，而頂部澄清現象較為突出。含有低聚果糖的酸乳中，底部也出現一定程度的澄清，這在一般酸乳中比較少見，且肉眼也未觀察到，可能是由于該儀器所測定的微觀沉淀和澄清與肉眼所觀察到的不一樣。

圖6 發酵及后熟期間不同酸乳樣品的穩定性動力學指數Fig. 6 Stability kinetic index of different yogurt samples during fermentation and ripening

穩定性動力學指數根據樣品的背散射光強度參比得出，反映樣品中穩定性的變化程度，其值越大表明穩定性越差[13]。由圖6可知，含有菊粉和低聚果糖酸乳的微觀穩定性低于空白樣品，可能是這2 種菊粉型低聚糖對乳液中蛋白質的解離和聚集造成的不良影響引起了體系紊亂。但是具體的穩定性情況還需要結合宏觀測定來綜合評定。而含有低聚半乳糖的酸乳在發酵期的微觀穩定性低于空白樣品，但后熟后其微觀穩定性較空白酸乳好。綜上，后熟期結束時，含有菊粉的酸乳的穩定性最差，低聚果糖、低聚半乳糖和空白樣品的穩定性較為接近，且添加低聚半乳糖的酸乳穩定性較好。

3 討 論

菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖3 種益生元均對酸乳的凝膠結構有一定的影響。掃描電子顯微鏡觀察到的酸乳微觀結構表明，與空白樣品相比，菊粉使酸乳的微觀結構更為完整，酪蛋白膠粒之間間隙增大，有助于酸乳形成均勻、疏松的微觀結構。Consolate等[28]研究發現添加菊粉濃縮酸乳的微觀結構較均勻、疏松且開放度較高，酪蛋白膠束相連成鏈狀，空隙數目較多且大小不一，推測可能是因為菊粉分子與水結合增加了連續相的黏度。在發酵期內，3 種益生元對酸乳凝膠形成過程中微流變學參數變化存在影響。添加低聚果糖酸乳的MVI、EI最大，SLB值最小，低聚果糖使酸乳形成較為穩定的凝膠體系，且呈現出較強的固體性質，因此說明含有低聚果糖酸乳的結構特性較好。還有學者通過研究添加菊粉和龍舌蘭果聚糖對減脂攪拌型酸乳的流變性和微觀結構的影響，發現菊粉在酪蛋白膠束聚集體之間形成二級凝膠結構，而果聚糖傾向于將自身沉積在酪蛋白膠束的表面[29]。

根據樣品的背散射光強度參比反映樣品穩定性的變化程度發現，含有菊粉和低聚果糖的酸乳微觀穩定性小于空白樣品，而含有低聚半乳糖的酸乳在發酵期的微觀穩定性小于空白樣品，但后熟后其微觀穩定性較空白樣品好。因此，含有低聚半乳糖酸乳的微觀穩定性要優于含有菊粉和低聚果糖的酸乳。添加3 種益生元酸乳的結構特性各有不同，未來還可研究分析3 種益生元復配對酸乳凝膠過程和微觀結構的影響，從而得出最優添加量。由于本實驗這些新的微觀研究方法在酸乳中應用還不常見，需要不斷探索以更清楚地了解菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖對酸乳微觀結構的影響，為進一步拓寬它們的應用提供依據。