殼聚糖浸泡對黃豆芽生長和主要生物活性物質含量的影響

呂霞敏，楊 睿，蔣 譽，黃建穎，董麗娟*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

黃豆是全球性農作物，具有產量高和營養豐富等特點[1]，經研究證明，豆芽的營養價值高于未發芽黃豆，其子葉含有豐富的蛋白質、脂肪、淀粉、無機鹽和維生素等[2]。植酸和多酚是黃豆中的抗營養化合物，超出一定含量范圍會降低黃豆的營養價值和蛋白質消化率[3]，通過發芽可以減輕抗營養化合物的影響，提高消化率[4-5]，增加營養成分含量，如增加L-抗壞血酸[6]、酚[7]、大豆異黃酮含量[8]。豆芽中含有蛋白質、礦物質、VC、纖維素、氨基酸等多種營養成分[9]，是一種天然的健康食品[10]，也可以作為促進健康的膳食補充劑[11]。但是一些加工者在豆芽生產過程中會使用一些添加劑來促進豆芽生長，這可能會危害到食用者的健康。為了改善這一問題，需要找到更多新的、有效的、可操作的提高豆芽產量與營養價值的培育方法。

殼聚糖（β-1,4-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖）化學名為脫乙酰幾丁質，是通過甲殼素脫乙酰基制得的低聚糖，主要從蝦蟹等甲殼類動物的外骨骼以及某些真菌的細胞壁中提取[12-14]。殼聚糖結構分子單元中大量的氨基和羥基為各種化學修飾提供了可能[15]，其所帶的正電荷還賦予了它很多獨有的生物、生理學特性，近年來被廣泛應用于美容、環境、農業、藥品和食品等行業。國外已有相關研究表明，殼聚糖用于豆芽生產，不僅可以提高產量，而且可以提高豆芽產品的品質，減少腐爛的發生[16]。究其原因，可能是殼聚糖的成膜性可在大豆表面形成具有微孔道的生物活性膜，從而影響呼吸作用。有研究證明，殼聚糖能夠顯著增強種子萌發時的呼吸速率，并隨其含量的增加作用增強，加速種子內的物質轉化，進而促進種子萌發生長[17]。但是目前針對殼聚糖處理對黃豆萌發期間生物活性物質含量的影響還鮮見報道。因此，本實驗以不同質量濃度的殼聚糖浸泡處理黃豆再培養成豆芽，研究殼聚糖浸泡處理對黃豆芽生長及所含生物活性成分的影響作用，以期將殼聚糖浸泡處理開發為一種有效、快速、健康的促進豆芽成為優質功能性食品的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆（‘牡丹圓粒91’） 黑龍江大用農業發展有限公司；水溶性殼聚糖（脫乙酰度為96.1%、黏度為20.0 mPa·s） 寧波海鑫生物制品有限公司；大豆苷、染料木素、大豆黃素、染料木黃酮、黃豆黃素、抗壞血酸、沒食子酸、槲皮素（標準品），乙腈、磷酸、甲醇和乙酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；植酸（標準品） 上海阿拉丁工業公司；福林-酚合肥博美生物科技有限責任公司；201×8型陰離子交換樹脂 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DYJ-A01自動豆芽機 中山榮威電器有限公司；LABCONCO冷凍干燥機 上海照生有限公司；QL-861漩渦振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；3-30K高速臺式冷凍離心機 德國Sigma公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；1100型高效液相色譜儀、1260型高效液相色譜儀、1200-6210型高效液相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆芽的培養

根據預實驗結果，選用0.2、0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的殼聚糖溶液對黃豆進行浸泡處理，并測得各溶液的pH值分別為3.75、3.71和3.62。挑選的黃豆用蒸餾水清洗3 次，室溫（（20±4）℃）下按照1∶4（m/V）比例分別于不同質量濃度殼聚糖溶液和蒸餾水（對照）中浸泡12 h。將浸泡好的黃豆平鋪于豆芽機中，以蒸餾水作為培養液，在25 ℃避光條件下恒溫培養（相對濕度90%），豆芽機每1 h自動循環噴灑蒸餾水2 min，每隔24 h更換一次培養液。

1.3.2 樣品的制備

培養期間，每天于豆芽機中進行隨機取樣，30 根黃豆芽為一組樣品，各設置3 個平行。取一部分豆芽立即液氮冷凍后于－80 ℃低溫保存；另一部分首先測定下胚軸長度和鮮質量，然后立即置于－80 ℃冷凍保存，再于冷凍干燥機中（－50 ℃）冷凍干燥30 h。冷凍干燥的豆芽樣品粉碎后過60 目篩，于－80 ℃冰箱密封保存備用。未發芽黃豆也經冷凍干燥、粉碎處理后于－80 ℃冰箱密封保存備用。

1.3.3 黃豆芽下胚軸長度和鮮質量的測定

使用軟尺測量每組樣品中每根豆芽的下胚軸長度，測量范圍為胚軸頂端到胚根長出處，求平均值；鮮質量使用稱量天平測量，求平均值。

1.3.4 黃豆芽中生物活性物質含量的測定

總抗壞血酸含量：參照Yun Juan等[18]的方法，取3.0 g黃豆芽樣品，加0.2%（質量分數，下同）的偏磷酸溶液冰浴研磨并定容至25 mL。靜置后于4 ℃、10 000×g離心15 min，取上清液，加入偏磷酸溶液定容至25 mL。取等體積的樣品溶液與20 mg/mL二硫蘇糖醇溶液混合，暗處反應30 min，待進樣測定。精確稱取25.0 mg抗壞血酸標準品，0.2%偏磷酸溶液溶解并定容至25 mL，分別取0.025、0.05、0.1、0.2 mL和0.4 mL溶液用偏磷酸溶液定容至25 mL作為標準溶液；取等體積的標準溶液與20 mg/mL的二硫蘇糖醇溶液充分混合，暗處反應30 min。以抗壞血酸標準溶液的質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線y=22 257x－0.830 6，R2=0.999 9計算總抗壞血酸含量，以每千克黃豆芽中抗壞血酸的質量表示。

高效液相色譜條件：Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.005 mol/L KH2PO4溶液（pH 2.65）、流動相B為甲醇；紫外檢測器檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量5 μL。

總酚含量：參照Paj?k等[19]的方法，取0.5 g黃豆和冷凍干燥豆芽，分別加入5 mL無水甲醇攪拌30 min，于4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液；再依次向沉淀物中加入5 mL和3 mL無水甲醇，相同條件離心，合并上清液，4 ℃保存備用。取0.75 mL樣品提取液于25 mL容量瓶，加入5 mL蒸餾水和1 mL福林-酚試劑，反應5 min后加入3 mL 12%（質量分數，下同）的Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL。避光反應2 h，測定765 nm波長處紫外吸光度。準確稱取0.1 g沒食子酸標準品，蒸餾水定容至100 mL，分別取1、2、3、4、5 mL于25 mL容量瓶中，蒸餾水定容。以沒食子酸質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線y=135.19x+0.008 8，R2=0.999 1計算總酚含量，結果表示為每克干樣品相當于沒食子酸的質量。

總黃酮含量：參照Guajardo-Flores等[20]的方法，取0.5 g樣品，加入10 mL體積分數60%乙醇溶液攪拌提取1 h，70 ℃、100 Hz/min超聲提取1 h，于4 000×g離心12 min，取0.6 mL提取液于25 mL容量瓶，加入0.5 mL 5%（質量分數，下同）NaNO2溶液，6 min后加入0.5 mL 10% Al(NO3)3溶液，反應6 min后加入4 mL 4% NaOH溶液，最后加體積分數60%乙醇溶液定容，靜置15 min后測定357 nm波長處吸光度。準確稱取2.0 mg槲皮素標準品，蒸餾水定容至10 mL，分別取0.3、0.6、0.9、1.2 mL和1.5 mL，加入0.5 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入0.5 mL質量分數10% Al(NO3)3溶液，6 min后加入4 mL 4% NaOH溶液，體積分數60%乙醇溶液定容至25 mL，15 min后測定357 nm波長處吸光度，以槲皮素作為標準品繪制標準曲線y=15.737x+0.674 9，R2=0.997 9，結果表示為每克干樣品相當于槲皮素的質量。

植酸含量：參照Frühbeck等[21]的方法，分別稱取0.5 g冷凍干燥黃豆粉和豆芽粉樣品，加入10 mL 0.66 mol/L HCl溶液中攪拌提取2 h，沸水浴3 min，于12 000×g離心30 min，取1 mL上清液，蒸餾水定容至25 mL（調節pH值為6）；取10 mL該稀釋提取液過陰離子交換柱，棄去收集液；15 mL蒸餾水淋洗，15 mL 0.1 mol/L NaCl溶液淋洗，棄去淋洗液；再用15 mL 0.7 mol/L NaCl溶液（調節pH值為3）洗脫并收集洗脫液。取10 μL 50%的植酸標準品定容于50 mL容量瓶，分別取1.6、0.8、0.4、0.2、0.025、0.0125 mL定容于10 mL容量瓶中。各取3 mL標準溶液與1 mL FeCl3-磺基水楊酸試劑混合均勻，室溫下反應15 min，于500 nm波長處測定吸光度。根據標準曲線y=2.884 1x+0.890 1，R2=0.999 2計算植酸含量，結果以mg/g表示。

1.4 數據處理與分析

實驗中每個樣品平行測量3 次，采用Excel 2010軟件統計分析數據，采用Origin 8.0軟件作圖，數據結果表示為的形式，使用Fisher檢驗的最小顯著極差法對數據進行顯著性分析，設置其顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 黃豆芽下胚軸長度與鮮質量分析

圖1 不同處理條件下黃豆芽的下胚軸長度（A）和鮮質量（B）變化Fig. 1 Changes in hypocotyl length (A) and fresh mass (B) of soybean sprouts under different treatments

如圖1所示，相比對照組，各質量濃度殼聚糖處理的豆芽下胚軸長度均有所增加（P＜0.05）。培養2 d時，質量濃度為0.2、0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的殼聚糖處理相對于對照組的增長率分別為10.48%、9.44%和7.64%；培養3 d時，增長率分別為19.88%、22.49%和35.39%；培養4 d時，增長率分別為24.0%、23.38%和26.01%。殼聚糖浸泡處理對黃豆芽鮮質量的影響與其對下胚軸長度的影響趨勢類似。與對照相比，各質量濃度殼聚糖溶液使豆芽的鮮質量增加顯著（P＜0.05），培養至5 d時，質量濃度為0.2、0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL殼聚糖溶液組相對于對照組鮮質量增長率分別為5.03%、12.89%和9.59%。其中，黃豆芽的下胚軸長度和鮮質量均在質量濃度0.4 g/100 mL殼聚糖處理并且培養5 d時達到最大值，結果表明殼聚糖浸泡處理對黃豆芽的下胚軸長度和鮮質量有顯著的正向影響。這說明一定質量濃度范圍內的殼聚糖作為外部誘導劑可促進黃豆芽的生長，且這與Mendoza-Sánchez[22]以及Pichyangkura[23]等的研究中證實殼聚糖可刺激植物生長的結論相一致。豆芽經過某些方式處理后，其生長過程中的一些代謝過程可能發生變化，例如植物組織或細胞的內源性激素平衡被改變，從而導致了芽長和根長的變化[20]。

2.2 黃豆芽生物活性成分含量的分析

2.2.1 總抗壞血酸含量分析

圖2 不同處理和培養時間對黃豆芽總抗壞血酸含量的影響Fig. 2 Effects of different treatments and germination time on total ascorbic acid content of soybean sprouts

如圖2所示，當殼聚糖溶液質量濃度為0.2 g/100 mL時，培養3 d的黃豆芽中總抗壞血酸含量（62.25 mg/kg）減少最為顯著（P＜0.05），相對于對照組（82.86 mg/kg）減少了29.39%，但培養5 d時，其總抗壞血酸含量（80.67 mg/kg）又上升至與對照組（81.52 mg/kg）相當的水平。黃豆芽培養2 d時，隨著殼聚糖溶液質量濃度的升高，黃豆芽中總抗壞血酸的含量隨之增加，但除了質量濃度為0.8 g/100 mL時總抗壞血酸含量（72.26 mg/kg）高于對照組（69.65 mg/kg），其他各質量濃度處理豆芽中的總抗壞血酸含量均低于對照組；培養3～5 d，總抗壞血酸含量呈先增后減的趨勢，在培養4 d的豆芽中出現最大值。其中，處理質量濃度為0.4 g/100 mL、培養4 d時出現最大總抗壞血酸含量（93.23 mg/kg），并且與對照組含量（93.33 mg/kg）相當。而培養5 d后，與培養4 d相比，所有樣品中的總抗壞血酸含量均下降，此時殼聚糖溶液質量濃度為0.2 g/100 mL處理的豆芽總抗壞血酸含量（76.32 mg/kg）高于其他質量濃度處理組，但略低于對照組（81.52 mg/kg）。實驗發現在未發芽的黃豆中沒有檢測到抗壞血酸，但其在發芽過程中顯著增加，浸泡和萌發后觀察到的總抗壞血酸含量增加可能是在打破休眠后開始的反應，以保護下胚軸生長免受由環境因素觸發的氧化反應，殼聚糖可能干擾總抗壞血酸生物合成酶，其作用機制復雜。Tommasi[24]和Xu Maojun[25]等指出，在黃豆芽的生長過程中，抗壞血酸生物合成途徑最后一步所需的谷氨酸脫氫酶的活性顯著提高，從而使得抗壞血酸的合成量增加，說明抗壞血酸在黃豆萌發過程中的積累是由于其生物合成酶被重新激活。但由本實驗結果發現，殼聚糖可能具有一定的影響谷氨酸脫氫酶活性作用。

2.2.2 總酚含量分析

圖3 不同處理和培養時間對黃豆芽總酚含量的影響Fig. 3 Effects of different treatments and germination time on total phenolic content of soybean sprout

如圖3所示，發芽導致總酚含量發生顯著變化，主要是由于內源酶的活化和種子在此過程中復雜的生化代謝[19,26-27]。培養3～5 d時，0.2 g/100 mL的殼聚糖處理的豆芽中總酚含量高于其他處理組，其中培養5 d時總酚含量達到最大值（5.12 mg/g），且培養4～5 d時的含量顯著高于對照組含量（P＜0.05），增長率分別為10.14%和10.88%。在整個發芽過程中，0.8 g/100 mL的殼聚糖溶液處理使得黃豆芽總酚含量總體顯著低于對照組。培養2～3 d時，殼聚糖溶液對豆芽中酚類物質的生成具有一定的抑制作用，整體上降低了豆芽中的總酚含量。待培養4～5 d時，殼聚糖溶液處理使得豆芽中總酚含量有所增加，且以質量濃度為0.2 g/100 mL的殼聚糖溶液促進作用最為明顯。總酚含量的增加主要是因為發芽過程中內源酶的激活以及復雜的生化代謝，使得細胞壁周圍的很多成分降解，游離態和結合態酚類化合物得到釋放，促進了酚類物質的合成[28]。Mendoza-Sánchez等[22]報道，經濃度為3.3 μmol/L和7 μmol/L的殼聚糖溶液處理后，豆芽中有3 種酚酸物質的含量增加較為明顯，說明殼聚糖可以促進豆芽中酚類物質的積累。許多種植物經殼聚糖處理后發生氧化反應，這導致植物防御酶被誘導生成，其中包括苯丙氨酸解氨酶，它是上述酚類化合物生物合成中的主要酶，能夠使得酚類化合物積累[29]。過量的酚類化合物具有抗營養特性，不同質量濃度殼聚糖浸泡的發芽黃豆芽中總酚含量在2.97～5.12 mg/g之間，表明殼聚糖質量濃度的變化對總酚含量有較大的影響。

2.2.3 總黃酮含量分析

如圖4所示，黃豆在發芽過程中黃豆芽中總黃酮含量不斷增加，且隨著殼聚糖處理質量濃度升高而增加，呈現質量濃度依賴性。未發芽黃豆中的總黃酮含量較低（0.03 mg/g）；待發芽后，質量濃度0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的殼聚糖溶液處理的黃豆芽中總黃酮含量增加較為顯著（P＜0.05），其中以質量濃度0.8 g/100 mL殼聚糖處理的促進作用最明顯。培養5 d時，質量濃度0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的殼聚糖溶液處理的黃豆芽總黃酮含量分別為0.51 mg/g和0.64 mg/g，相對于對照組增長率分別為39.61%和76.06%。而質量濃度為0.2 g/100 mL的殼聚糖處理的黃豆芽總黃酮含量明顯低于其他處理組，且與未處理組最為相近。發芽過程中黃酮類化合物含量的增加也可能是由于大分子質量多酚（如鞣酸）參與黃酮類化合物生物合成酶的激活所致[30]。此外，殼聚糖浸泡處理使總黃酮含量整體上得以增加，且以質量濃度為0.8 g/100 mL的殼聚糖溶液促進總黃酮含量增長的作用最為明顯。Guajardo-Flores等[20]針對豆類的研究發現，豆類種子中的總黃酮含量隨著其發芽而增加，本實驗的結果與之相符合。

圖4 殼聚糖浸泡處理對黃豆芽中總黃酮含量的影響Fig. 4 Effect of chitosan on total flavonoid content of soybean sprouts

2.2.4 植酸含量分析

圖5 培養時間對黃豆芽中植酸含量的影響Fig. 5 Effects of different treatments and germination time on phytic acid content of soybean sprouts

如圖5所示，定量結果表明未發芽黃豆的植酸含量為7.40 mg/g。隨著培養時間延長，特別是在高質量濃度的殼聚糖溶液組中觀察到植酸含量明顯降低。值得注意的是，0.4 g/100 mL殼聚糖處理時，植酸含量始終與對照組含量相當；培養5 d時，與未萌發黃豆相比，植酸含量降低70.81%～78.92%；培養5 d時，0.8 g/100 mL殼聚糖處理的豆芽中植酸含量最低（1.56 mg/g，與黃豆相比降低78.92%）。Mendoza-Sánchez等[22]發現，菜豆發芽過程中植酸含量相比原始的種子減少了36%，而在經過不同濃度（3.3 μmol/L和7 μmol/L）的殼聚糖溶液浸泡處理后，豆芽中植酸的含量減少得更多，且質量濃度越高的殼聚糖溶液表現出的降低效果越明顯。Wang Xinkun等[31]也報道培養豆芽時補充適宜質量濃度的Ca2+可以明顯降低生長過程中所含植酸的含量，因為Ca2+可以提高植酸酶的活性，促進植酸分解成無機磷。在發芽過程中，植酸化合物因為植酸酶的分解作用以及作為能量來源而減少；在額外的環境刺激存在時，更高的能源需求使得植酸更迅速地分解。殼聚糖浸泡可降低黃豆芽中植酸的含量，說明殼聚糖浸泡也有可能提高了黃豆發芽過程中的植酸酶活性，促進了植酸的分解作用。

3 結 論

目前，已有關于不同質量濃度及不同脫乙酰度的殼聚糖[32-33]或殼聚糖衍生物[34]對豆芽生長的研究，但僅限于對豆芽的產率、莖長、莖粗、須根數、硬度、水分含量等方面的影響。針對殼聚糖處理對黃豆萌發期間生物活性物質含量的作用尚鮮見報道。本研究采用分光光度法和高效液相色譜法探究不同質量濃度殼聚糖處理對黃豆芽生長和主要生物活性物質含量的影響，以期能對相關研究方法進行拓展豐富。本實驗結果表明，一定質量濃度范圍內的殼聚糖作為外部誘導劑可促進黃豆芽的生長，黃豆芽生長過程中的殼聚糖對黃豆芽鮮質量的影響與下胚軸長度相似，說明殼聚糖處理可使得黃豆芽的產量增加，其影響不僅僅表現于豆芽形態上的變化，也應該表現于豆芽中化學成分含量的變化。此外，殼聚糖浸泡處理也會對黃豆芽中的主要生物活性物質含量產生一定影響。殼聚糖浸泡處理可以考慮作為一種生產低成本功能性食品的替代技術，殼聚糖的劑量是關鍵。本實驗只研究了不同質量濃度殼聚糖處理對于黃豆芽生長與生物活性物質的影響，若進一步探究殼聚糖對果蔬的作用機理，將為殼聚糖更廣泛的應用提供依據。