超聲波處理對黑加侖果實多糖性質與生物活性的影響

徐雅琴，杜明陽，楊 露，劉育松，魏 紅，鄭彬浩，郭瑩瑩，楊 昱*

（東北農業大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑加侖別名黑穗醋栗，其果實富含多種維生素、糖類、有機酸和花青素等。研究發現，黑加侖果實不僅是一種營養豐富的水果，而且具有多種保健功效，如具有改善視功能、降血脂和降血壓等功效[1-2]。多糖是黑加侖果實主要活性物質之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗糖化等作用[3-4]。研究表明，天然多糖的生物活性受到其分子質量和結構特征的影響[5-6]。本課題組前期制備得到的黑加侖果實多糖大多具有較大的分子質量，水溶性差，一定程度上影響了多糖的生物活性[7-8]。因此，選擇適宜的方法對黑加侖果實多糖進行降解，制備不同低分子質量多糖，可為篩選高活性黑加侖果實多糖提供依據。

超聲波作為一種綠色高效的降解方法，具有操作簡單、可控性好的特點，其在食品和醫藥工業中用于多糖的降解引起了廣泛的關注[9-10]。超聲波引發的多糖降解是由超聲空化（機械效應）引起的。超聲波處理誘導液體介質內部空化氣泡的快速形成和坍塌，產生強烈的壓力使多糖分子中共價鍵斷裂，進而導致多糖的降解[8]。與化學降解和熱降解不同，超聲波降解是一個非隨機過程，其引起的壓力一般發生在分子的中心，并從內向外輻射[10-11]。研究表明超聲不僅可以改變多糖的理化性質（分子質量、黏度、溶解度和流變性等），還可以提高多糖的生物活性，如抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗炎活性[5-6,9-10]等。例如，Yan Jingkun等發現高強度超聲波處理能夠在短時間內降低桑黃菌絲多糖特性黏度和分子質量，而一級結構基本沒有變化，同時降解多糖具有更高的羥自由基清除能力和總抗氧化能力[5]。Du Bin等利用超聲波降解Schizophyllum commune菌絲胞外多糖，結果表明，與原多糖相比，降解多糖分子質量和黏度降低，抗炎活性顯著提高[6]。目前，關于超聲降解對黑加侖果實多糖的性質和生物活性影響的報道較少。因此，本實驗利用超聲波處理黑加侖果實多糖，制備兩種不同分子質量多糖，對其理化性質、結構初步特征和體外生物活性進行研究，以期為探究黑加侖果實多糖構效關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖（Ribes nigrum L.）為‘布勞德’成熟果實，由黑龍江省東北農業大學園藝站提供，－20 ℃冰箱真空密封冷藏備用。

木瓜蛋白酶 北京奧博星生物科技有限公司；果膠酶 上海藍季生物科技有限公司；D4006型大孔吸附樹脂 南開大學化工廠；大豆卵磷脂 天津市光復精細化工研究所；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY92-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ-7200型可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；UV-2700雙光束紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；振動黏度計 日本Sekonic公司；FTS135型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加侖果實多糖的制備

根據課題組已探究的復合酶法制備多糖：黑加侖果實勻漿加入去離子水中，料液比為1∶20，加入木瓜蛋白酶0.3%（質量分數，下同）、果膠酶0.15%，50 ℃下水浴振蕩50 min，然后沸水浴10 min后抽濾、濃縮，用3 倍體積的無水乙醇醇沉，4 ℃冰箱靜置過夜，粉紅色沉淀即為粗多糖。參考文獻[8]的方法，使用D4006型大孔樹脂對粗多糖溶液進行純化。所得多糖溶液流水透析（截留分子質量為3 500 Da）48 h。將透析后的多糖溶液進行離心、濃縮、冷凍干燥，得到初步純化的多糖樣品，命名為原多糖（BFPs）。

1.3.2 黑加侖果實降解多糖的制備

利用超聲波細胞粉碎機對BFPs溶液（5.0 mg/mL）進行降解。脈沖模式（開1 s、關1 s），超聲溫度不高于50 ℃，超聲功率固定為700 W，降解時間分別為15 min和30 min。降解后多糖溶液經透析（截留分子質量為3 500 Da，48 h）、濃縮、冷凍干燥，得到兩種降解多糖UM-15和UM-30。

1.3.3 超聲降解對黑加侖果實多糖理化性質的影響

1.3.3.1 黏均分子質量

分別配制質量濃度為5.0 mg/mL的原多糖和降解多糖溶液，利用烏氏黏度法[5]測定其特性黏度[η]，代入Mark-Houwink方程：lg[η]＝0.314 6 lg Mv－0.190 7，即可得到降解前后黑加侖多糖的黏均分子質量（Mv）。

本實驗Mark-Houwink方程確定方法如下：根據適合測定多糖Mv的Mark-Houwink非線性方程[η]＝KMvα，得到公式lg[η]＝lg K＋αlg Mv，式中：[η]為特性黏度，Mv為黏均分子質量，K為比例常數，α為經驗參數。

通過測定葡聚糖標準品（T-40、T-110、T-500、T-2000）特性黏度[η]，以lg[η]-lg Mv作圖，所得曲線斜率即為α值，截距即為lg K。

1.3.3.2 振動黏度

分別配制質量濃度為5.0 mg/mL的原多糖和降解多糖溶液，使用振動黏度計測量其振動黏度。

1.3.3.3 溶解度

參考Chen Jialun等的方法[12]，并稍加修改。取多糖樣品200 mg溶于5 mL的去離子水中，在室溫下振蕩攪拌24 h?；旌衔? 000 r/min離心30 min，然后將上清液除去。將剩余不溶物烘干，稱質量。以上步驟每個樣品重復3 次。溶解度按公式（1）計算。

1.3.3.4 組分分析

采用苯酚-硫酸法[13]測定總糖質量分數；利用二硝基水楊酸法[14]測定還原糖的質量分數；以葡萄糖醛酸為標準，采用咔唑-硫酸法[15]測定糖醛酸的質量分數；利用考馬斯亮藍法[16]測定蛋白質量分數；利用福林-酚法[17]測定多酚質量分數。

1.3.4 超聲降解對黑加侖果實多糖結構的影響

1.3.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法，對多糖BFPs，UM-15和UM-30在4 000～500 cm－1范圍內進行傅里葉變換紅外光譜掃描。

1.3.4.2 剛果紅實驗

參考Xu Yaqin等的方法[18]，將BFPs、UM-15和UM-30與剛果紅試劑分別配制成一系列不同NaOH濃度的反應體系，在400～700 nm波長范圍內，利用紫外-可見分光光度計進行掃描，測定溶液的最大吸收波長。用去離子水代替多糖溶液作為空白對照組。

1.3.4.3 碘-碘化鉀實驗

向試管中加入2.0 mL多糖溶液（2.0 mg/mL），加入2 mL H2O，再加入1.2 mL碘-碘化鉀試劑（含0.02%（體積分數，后同）I2的0.2% KI溶液），振蕩混勻后，室溫下在300～700 nm波長范圍內掃描。

1.3.5 超聲降解對黑加侖果實多糖生物活性的影響

參照文獻[1 9]的方法，配制質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的多糖溶液，測定多糖的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·清除率。以VC作為陽性對照。

1.3.5.2 抗脂質過氧化實驗

試液的配制：300 mg大豆卵磷脂超聲輔助溶解于30 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（10 mmol/L、pH 7.4）中，得到脂質體PBS分散系（lecithin liposome system，LLS）。將15.00 g三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、0.37 g硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、2.10 mL濃鹽酸依次加入100.0 mL水中，得到TCA-TBA-HCl混合液。

抗脂質過氧化能力的測定方法參照Yang Dong等的方法[20]并作稍許改動，分別于試管中加入1.0 mL LLS、1.0 mL 0.4 mmol/L硫酸亞鐵、1.0 mL不同質量濃度的多糖樣品并混合均勻。在避光條件下37 ℃水浴60 min，之后加入2.0 mL TCA-TBA-HCl混合液，并于100 ℃水浴15 min，立即冷卻，以3 000 r/min離心10 min，取上清液在535 nm波長處測吸光度As?？瞻滓?.0 mL去離子水代替1.0 mL樣品，操作方法同上，可測得空白的吸光度Ac，以VC為陽性對照。按公式（2）計算抑制率。

式中：Ac為不加多糖樣品溶液的脂質氧化體系的吸光度；As為加多糖樣品溶液的脂質氧化體系的吸光度。

式中：A0為不加多糖樣品溶液的吸光度；Aa為加入多糖樣品溶液的吸光度；Ab為多糖溶液本身的吸光度。

1.4 數據處理與分析

所有實驗數據均以3 次實驗結果的平均值±標準差表示。采用Origin 8.0軟件作圖，并用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析（單因素方差分析法），P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黑加侖多糖的理化性質

由表1可知，隨著降解時間延長，多糖的Mv顯著降低（P＜0.05），降解15 min時，Mv減少56.97%，降解時間延長到30 min時，Mv減少65.94%。同樣地，在超聲降解時間分別為15 min和30 min時，其振動黏度分別降低了11.86%和16.49%。顯然，在一定范圍內，延長超聲作用時間，會提高多糖的降解程度。此結果與Hu Jielun等的研究結果[22]一致。該研究發現，超聲波處理可以顯著降低車前子種子多糖的分子質量和黏度等。溶解度測定結果表明，利用超聲波處理黑加侖多糖可以顯著增加樣品的溶解度（P＜0.05）。超聲處理15 min后，多糖的溶解度增加了27.97%。當處理時間延長至30 min時，UM-30的溶解度增加了61.53%。這可能是由于大分子質量多糖的解聚并伴隨著較短聚合鏈比例的增加，導致降解多糖的水合趨勢增強和鏈間氫鍵數量減少[12]。

表1 多糖BFPs、UM-15和UM-30的理化性質Table 1 Physicochemical properties of BFPs, UM-15 and UM-30

此外，由表1可知，經過初步純化后的多糖BFPs已經不含蛋白質和多酚。降解多糖UM-15和UM-30與BFPs的總糖質量分數不存在顯著差異。但是，還原糖和糖醛酸質量分數顯著增加（P＜0.05），且呈時間-效應關系。還原糖質量分數增加說明超聲波處理使多糖糖鏈發生斷裂，多糖分子質量降低。而超聲波處理后多糖中糖醛酸質量分數增加可能是超聲波處理使位于多糖內部更多的糖醛酸暴露出來所致[23]。

2.2 黑加侖多糖的結構初步表征

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖1 BFPs、UM-15和UM-30的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of BFPs, UM-15 and UM-30

由圖1可以看出，BFPs及UM-15、UM-30均具有多糖的特征吸收且特征吸收峰位置基本相同，說明降解前后多糖分子的主要官能團沒有變化。在3 400 cm－1處的峰為羥基O—H的伸縮振動吸收峰，2 907 cm－1附近的峰為C—H的伸縮振動吸收峰，1 730 cm－1附近的峰為酯化羰基C=O伸縮振動，1 603 cm－1附近的峰為羧基C=O的伸縮振動峰，此外1 430 cm－1處的吸收峰說明BFPs、UM-15和UM-30中均含有糖醛酸，在1 200～1 000 cm－1處存在的吸收峰說明降解前后多糖均為吡喃糖結構[4]。綜上可知，超聲波作用于黑加侖果實多糖后并沒有改變基本結構。

2.2.2 剛果紅實驗分析結果

圖2 不同NaOH濃度下多糖與剛果紅絡合物的最大吸收波長λmaxFig. 2 Maximum absorption wavelength of Congo red and Congo red-polysaccharides at various concentrations of NaOH

由圖2可以看出，隨著NaOH溶液濃度從0增大到0.5 mol/L，多糖BFPs及UM-15、UM-30與剛果紅試劑作用產生絡合物的最大吸收波長均呈現逐漸減小的趨勢。最大吸收波長的連續下降可能是因為多糖在水溶液中為無規卷曲構象，且越來越多的氫鍵被堿性溶液破壞[24]。3 種多糖在水溶液中具有無規卷曲構象，可能歸因于這些多糖較大的分子質量和復雜的單糖組成[25]。Mao等指出雜多糖不能形成三螺旋結構[26]。因此UM-15、UM-30和BFPs都不具有三股螺旋結構。

2.2.3 碘-碘化鉀實驗分析結果

圖3 多糖BFPs及UM-15、UM-30的碘-碘化鉀實驗紫外-可見光譜圖Fig. 3 Ultra violet-visible absorption spectra of BFPs, UM-15 and UM-30 reaction with iodine-potassium iodide

如圖3所示，多糖BFPs及UM-15、UM-30與碘-碘化鉀試劑的反應液在350 nm波長處均有強吸收峰，在565 nm波長處沒有吸收峰，這說明多糖BFPs、UM-15和UM-30均具有復雜的鏈狀結構，其側鏈較長、支鏈較多[27]。綜上可知，超聲波并未改變黑加侖果實多糖的復雜分支結構。

2.3 黑加侖多糖的體外生物活性

2.3.1 清除DPPH自由基和O2－·能力

由圖4、5可知，多糖BFPs、UM-15和UM-30在質量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內，隨著多糖質量濃度的增加，其對DPPH自由基和O2－·的清除作用增強，呈現明顯的濃度依賴關系，且不同多糖清除自由基能力呈現顯著差異（P＜0.05）。在最大實驗質量濃度（1.2 mg/mL）時，BFPs、UM-15和UM-30的DPPH自由基清除率達到最大值，分別為（85.02±2.32）%、（87.26±1.68）%、（9 0.1 8±0.6 6）%，低于V C的最大清除率（96.97±2.51）%，BFPs、UM-15、UM-30和VC的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.269、0.228、0.207 mg/mL和0.031 mg/mL。同時，BFPs、UM-15、UM-30和VC的最大·清除率和IC50分別為（52.87±2.08）%和1.193 mg/mL、（66.83±1.56）%和0.676 mg/mL、（71.43±0.25）%和0.269 mg/mL、（76.68±0.62）%和0.003 mg/mL。由此可見，清除DPPH自由基和·能力順序為VC＞UM-30＞UM-15＞BFPs。

圖4 BFPs、UM-15和UM-30對DPPH自由基的清除能力Fig. 4 DPPH radical scavenging capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

圖5 BFPs、UM-15和UM-30對·的清除能力Fig. 5 Superoxide anion radical scavenging capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

2.3.2 抗脂質過氧化能力

由圖6可知，在質量濃度為0.2～1.2 mg/mL范圍內，多糖BFPs、UM-15及UM-30對脂質過氧化的抑制作用均高于VC。隨著多糖質量濃度的增加，3 種多糖對脂質過氧化的抑制作用均逐漸增強，且存在顯著差異（P＜0.05）。當質量濃度為1.2 mg/mL時，多糖對脂質過氧化的抑制效果達到最佳水平。此時，多糖BFPs、UM-15和UM-30的脂質過氧化抑制率分別為（44.44±0.22）%、（55.35±0.16）%、（65.83±0.67）%，分別是VC最大抑制率的1.60、1.99、2.36 倍。BFPs、UM-15、UM-30和VC的IC50分別為1.971、1.035、0.771 mg/mL和3.394 mg/mL。

圖6 BFPs、UM-15和UM-30對脂質過氧化的抑制能力Fig. 6 Lipid peroxidation-inhibitory capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

圖7 BFPs、UM-15和UM-30對的清除能力Fig. 7 Nitrite ion scavenging capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

由圖7可以看出，在0.2～4.0 mg/mL范圍內，BFPs、UM-15及UM-30對的清除率隨著質量濃度增大而增強，且不同多糖對的清除能力存在顯著差異（P＜0.05）。質量濃度達4.0 mg/mL時，BFPs（（73.08±1.25）%，IC50=1.384 mg/mL）、UM-15（（78.65±0.58）%，IC50=0.990 mg/mL）及UM-30（（84.46±1.43）%，IC50=0.697 mg/mL）的清除率達到最大，但仍低于VC的最大清除率（（97.12±2.34）%，IC50=0.017 mg/mL）。

綜上所述，超聲波處理能夠導致黑加侖果實多糖抗氧化活性顯著提高。通常，活性物質的抗氧化作用歸因于其供氫能力。Wang Junlong等研究發現，多糖中糖醛酸基團的存在可以觸發異頭碳的氫原子，發生抗氧化反應[28]。本實驗結果表明超聲波處理能夠使黑加侖多糖中糖醛酸含量增加，提高多糖供給氫原子的能力，進而增加多糖的抗氧化活性，這與You Qinghong等研究結果一致[29]。另一方面，超聲波處理能夠使多糖分子質量降低，使位于多糖內核中的活性基團暴露，提供更多的活性位點與自由基反應，進而抑制氧化反應[23]。此外，本研究發現原多糖與降解多糖對DPPH自由基、O2－·的清除能力及抗脂質過氧化能力存在差異，這可能是由于多糖發揮不同抗氧化活性時作用機制是不同的。Sun Liqin[30]、Shi Meijia[31]等在研究原多糖與降解多糖抗氧化活性時得到與本實驗一樣的結論。關于天然多糖抗氧化活性作用機制及多糖在不同實驗方法中抗氧化活性存在差異的原因有待進一步深入探討。

3 結 論

本實驗利用超聲波降解黑加侖果實多糖，制備了兩種不同分子質量多糖。研究結果表明，超聲時間越長對多糖的理化性質（黏均分子質量、振動黏度、溶解度、還原糖含量和糖醛酸含量）的影響越顯著；與原多糖相比，超聲波處理并沒有改變多糖的基本結構；此外，降解多糖對DPPH自由基、O2－·和NO2－的清除能力及對脂質過氧化的抑制作用均強于原多糖，且降解時間越長效果越好。因此，超聲波是一種在不破壞多糖初級結構的條件下，有效地改善多糖的理化性質，并提高其生物活性的手段，而超聲波處理的黑加侖果實多糖可能成為保障人類健康的天然抗氧化劑潛在來源。