植物乳桿菌YW11殺菌型發酵乳調節腸道菌群結構

郝曉娜，羅天淇，張 健，趙 笑，余志堅，曹永強，楊貞耐,*

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京 100048；2.東君乳業（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

人體胃腸道內寄居著種類繁多的微生物，腸道菌群能幫助宿主消化吸收食物中的營養物質，并代謝宿主腸道中產生的有毒廢物，同時產生人體必需的氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸等功能物質為宿主所用。腸道菌群被認為是調節宿主新陳代謝和免疫系統的“器官”[1]。越來越多的研究證明腸道菌群對人體的健康和生活起著復雜且至關重要的作用。許多研究表明腸道菌群與代謝綜合征、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）和結直腸癌等疾病有著密不可分的關系[2-3]。IBD是一種慢性易復發的腸道疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD）。

世界衛生組織和聯合國糧食及農業組織專家組認為，攝入足量的益生菌有益于人體的健康，關注最多的是益生性乳酸菌，如乳桿菌和雙歧桿菌[4]。乳酸菌的腸道調節作用被認為歸因于有益腸道細菌的增加和有害細菌的減少[5]，并且由有害細菌的增殖引起的腹瀉可通過攝入含有乳酸菌的酸乳來緩解[6]。發酵乳被認為是益生菌的良好載體。Granata等[7]發現攝入含有鼠李糖乳桿菌的發酵制品能顯著增加老年人腸道中乳桿菌的數量。?zcan等[8]研究發現發酵乳能顯著増加人體腸道乳桿菌和雙歧桿菌的數量，提高健康人群總厭氧菌中雙歧桿菌的比例，顯著降低有害產氣莢膜梭菌的數量。孫建華等[9]研究表明雙歧桿菌BB12活菌型發酵乳能促進雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，降低腸桿菌和腸球菌的數量。發酵乳不僅可以增加腸道內乳桿菌的數量，而且可以在一定程度上促進小鼠排便[10]。發酵乳能提高便秘小鼠的腸道推進率，有效地改善便秘問題[11]。

關于活菌型發酵乳對腸道菌群的作用研究比較多，但是對巴氏殺菌發酵乳的研究相對較少。作為具有良好益生特性的植物乳桿菌菌株，當被用于發酵牛乳飲料生產時，它不僅顯示出在產品中的高存活率，而且攝入后具有對胃酸和膽汁酸的良好耐受性，能抑制腸道有害細菌的增殖，有助于腸道菌群的平衡[12]。本實驗研究具有耐酸性、耐膽鹽、降低膽固醇作用[13]的益生性植物乳桿菌YW11發酵液對常見病原菌的抑制作用，并將該菌株作為發酵劑應用于巴氏殺菌發酵乳的制備，通過體外模擬人體消化模型，與人體糞便共培養，考察巴氏殺菌發酵乳對人體腸道菌群結構的影響，旨在為益生性巴氏殺菌發酵乳的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌YW11分離于西藏靈菇樣品，乳雙歧桿菌由北京工商大學乳制品實驗室保藏。沙門氏菌22956、福氏志賀氏菌21534、阪崎腸桿菌21544、動物雙歧桿菌21709 中國工業微生物菌種保藏管理中心；李斯特氏菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825 廣東微生物菌種保藏中心。

MRS培養基、LB培養基、肉湯培養基、BHI培養基、PTYG培養基、BCM培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；DNA提取試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

705型－80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Electron公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；BCN-1360B超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HZQ-Q恒溫培養箱 上海一恒實驗設備有限公司；U-3900紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌YW11抑菌作用的測定

指示菌的活化：將沙門氏菌22956、福氏志賀氏菌21534、阪崎腸桿菌21544、大腸桿菌CMCC44825以體積分數3%接種在LB培養基中，37 ℃培養24 h。將李斯特氏菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌CMCC26071以體積分數3%分別接種在BHI培養基、肉湯培養基中，37 ℃培養24 h。將動物雙歧桿菌21709以體積分數3%的接種在PTYG培養基中，37 ℃厭氧培養18 h。活化兩代后備用。

植物乳桿菌YW11上清液制備：植物乳桿菌YW11在MRS液體培養基中活化兩代后，5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm無菌濾膜備用。

植物乳桿菌抑菌活性的測定：根據Dasari等[14]的方法稍作修改。向96 孔板中加入100 μL的LB、BHI、PTYG、肉湯培養基，取活化的指示菌，以體積分數3%接種在相應的培養基中。取100 μL菌株YW11上清液加入到96 孔板中，對照組加入100 μL MRS培養基。37 ℃培養24 h，在600 nm下測定吸光度。抑菌率的計算見公式（1）。

式中：A0為對照組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

1.3.2 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群的影響

1.3.2.1 實驗分組

實驗分組如表1所示。

表1 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群影響的實驗分組Table 1 Experimental grouping and sampling schemes

1.3.2.2 巴氏殺菌發酵乳的制備

植物乳桿菌YW11按照體積分數3%接種于MRS培養基中，37 ℃培養18 h活化兩代后備用。

全脂乳預熱至60～75 ℃，40 MPa下均質，95 ℃殺菌5 min，冷卻至42 ℃并按體積分數5%將活化兩代后的植物乳桿菌YW11接入全脂乳中，于42 ℃下發酵至pH 4.5，迅速置于68～70 ℃水浴鍋中，并保持此溫度30 min后急速冷卻到4 ℃，制成巴氏殺菌發酵乳，樣品于4 ℃冷藏備用。

1.3.2.3 巴氏殺菌發酵乳的體外模型消化處理

采用Jin Yan等[15]的方法并稍作修改，10 mL的巴氏殺菌發酵乳與等體積的35 mmol/L NaCl溶液混合，用HCl調至pH 2.0，以胃蛋白酶與底物質量比1∶100加入胃蛋白酶，37 ℃水解1 h。然后用NaOH溶液調至水解液pH 7.0，以胰蛋白酶與底物質量比1∶100加入胰蛋白酶，37 ℃消化1 h制得消化后的樣品。

1.3.2.4 糞懸液的制備

于實驗當天采集健康成人（2男1女，年齡20～28 歲）糞便，志愿者能夠提供14 d內的體檢報告，無腸道和慢性代謝疾病，90 d內未服用抗生素，正常飲食，無飲酒、中藥。往50 mL離心管中預先加入20 mL PBS，稱質量并記錄。迅速挖采足夠的中段糞便樣品（至少15 g）放入離心管中，漩渦振蕩混勻后稱質量，用質量差法計算需要再添加的PBS質量，糞懸液終體積分數為20%。在厭氧工作站中添加PBS，用兩層紗布濾去大顆粒殘渣，用小燒杯收集濾液，于2 h內完成糞懸液的處理[16]。

1.3.2.5 巴氏殺菌發酵乳與健康人體糞便共培養

取消化后的樣品1 mL與0.5 mL的糞懸液混合，加入3.5 mL BCM培養基形成培養體系，將所有體系置于厭氧工作站，37 ℃恒溫，站內氣體組成為體積分數80% CO2、10% N2和10% H2，相對濕度75%，分別培養4、12 h取樣。空白組加入和樣品等體積的PBS。

1.3.2.6 16S rRNA測定菌群組成多樣性

選用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取培養物中的總DNA，并通過質量分數0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用Q5高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，PCR擴增產物通過質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并采用AXYGEN凝膠回收試劑盒對目標片段進行切膠回收。參照電泳初步定量結果，將PCR擴增回收產物進行熒光定量，根據熒光定量結果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。使用Illumina MiSeq系統進行上機測序，采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，以97%的序列相似度作為運算分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分閾值，和NCBI進行BLAST比較。

通過QIIME軟件分別對每個樣本計算Chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數。Chao1指數（SChao1）通過計算群落中只檢測到1 次和2 次的OTU數目，估計群落中實際存在的物種數，如式（2）所示計算。ACE指數（Sace）用來估計群落中含有OTU數，由Chao[17]提出，是生態學中估計物種總數的常用指數之一，如式（3）所示計算。Shannon指數（HShannon）包含物種和各種間個體分配的均勻性兩個部分，如式（4）所示計算。Simpson指數（DSimpson）為隨機抽取的兩個個體屬于不同種的概率，如式（5）所示計算。

式中：Sobs為實際測量出的OTU數；n1為只含有一條序列的OTU數；n2為只含有兩條序列的OTU數。

式中：ni為含有i條序列的OTU數；Srare為含有不超過“abund”條序列的OTU數；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數；abund為“優勢”OTU的閾值，默認為10。

式中：Sobs為實際測量出的OTU數；ni為含有i條序列的OTU數；N為所有的序列數。

式中：Sobs為實際測量出的OTU數；ni為含有i條序列的OTU數；N為所有的序列數。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌YW11發酵液的抑菌作用

益生菌對常見疾病的療效作用是微生物群落研究中最具有前景的領域之一。植物乳桿菌YW11發酵液對常見病原菌如沙門氏菌22956、福氏志賀氏菌21534、阪崎腸桿菌21544、李斯特氏菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825和益生菌雙歧桿菌的抑菌率分別為23.94%、10.81%、6.07%、34.18%、13.25%、3.33%、2.35%（圖1）。其中李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌屬厚壁菌門，大腸桿菌和沙門氏菌屬變形菌門。

圖1 植物乳桿菌YW11發酵液對常見病原菌和雙歧桿菌的抑菌作用Fig. 1 Inhibition rates of common pathogenic bacteria and Bifidobacteria by the fermenteation supernatant of L. plantarum YW11

據報道，沙門氏菌可引起慢性腸炎，多發生在幼兒和老年人群中。阪崎腸桿菌感染可引起小腸結腸炎，感染的大多數為嬰兒，特別是早產兒、出生體質量偏低等身體狀況較差的新生兒。一旦感染李斯特氏菌，患者會出現發燒、肌肉疼痛、惡心、腹瀉等癥狀，但這種疾病不會迅速發病，具有一定的潛伏期。福氏志賀氏菌的菌毛能黏附于結腸黏膜的上皮細胞表面，繼而在侵襲蛋白作用下穿入上皮細胞內；其產生的內毒素能作用于腸壁，破壞黏膜，形成炎癥、潰瘍，出現典型的膿血黏液便。金黃色葡萄球菌能夠產生數種引起急性腸炎的蛋白質和腸毒素，分為A、B、C1、C2、C3、D、E及F 8 種血清型，對腸道破壞性大。大腸桿菌在不致病的情況下與人體互利共生，它寄生在人體大腸和小腸里，不但不會給人們的身體健康帶來任何危害，反而可以幫助人體合成VK2，但在機體免疫降低、腸道缺乏刺激等特殊情況下會造成感染。某些大腸桿菌能侵入大腸、小腸黏膜，引起潰瘍甚至出血，血清型大腸桿菌可引起人類腹瀉。本研究植物乳桿菌YW11發酵液對上述病原菌均有不同程度的抑制作用，表明植物乳桿菌YW11發酵液對腸道菌群可能存在潛在的調節作用。YW11發酵液對動物雙歧桿菌也表現出抑制作用，可能的原因是動物雙歧桿菌為產酸性益生菌，植物乳桿菌發酵降低了培養體系中的pH值，對動物雙歧桿菌的生長有抑制作用。

2.2 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群的影響

2.2.1 菌群α多樣性分析

圖2 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群OTU數的影響Fig. 2 Rarefaction curves of operational taxonomic unit (OTU) number

通過對腸道菌群微生物進行OTU劃分，并繪制稀釋曲線（圖2）。一方面，稀釋曲線越來越平緩，說明當前測序的深度足以反映該樣品中所包含的物種的多樣性；另一方面，稀釋曲線可以反應同一測序深度下不同樣品中物種的多樣性。由圖2可知，YW11組和對照組分別進行體外糞便共培養4 h和12 h的稀釋曲線均高于空白組，說明相同的測序深度下，YW11組和對照組樣品中OTU數多于空白組，共培養12 h后市售巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群多樣性的改善作用略優于YW11巴氏殺菌發酵乳。

評定腸道菌群α多樣性的指數有Chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數。Chao1指數和ACE指數側重于表示群落的豐富度，其值越大，群落的豐富度越高。Shannon指數和Simpson指數綜合考慮群落的豐富度和均勻度，其值越大，群落的多樣性越高。從圖3可知，經消化的植物乳桿菌巴氏殺菌發酵乳和市售巴氏殺菌發酵乳與人體糞便共培養4、12 h之后，樣品組Chao1指數和ACE指數高于空白組，說明植物乳桿菌巴氏殺菌發酵乳和市售巴氏殺菌發酵乳能夠增加腸道菌群的豐富度。Shannon指數和Simpson指數組間無顯著性差異（P＞0.05）。許多研究發現，腸道菌群多樣性的下降與IBD炎癥的產生密切相關[18]。因此，在一定程度上，巴氏殺菌發酵乳能通過增加腸道菌群的多樣性緩解IBD炎癥的癥狀。

圖3 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群多樣性指數的影響Fig. 3 Effect of the pasteurized fermented milk on species diversity index of the intestinal flora

2.2.2 菌群的結構分析

圖4 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群門水平結構的影響Fig. 4 Classification and composition of bacterial populations at the phylum level

人類腸道中能夠檢測并明確的菌群很少，主要包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）四大類[19]。本實驗對OTU在每個門的數量進行了統計，結果如圖4所示。厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門占總細菌數量的99.95%以上。每個樣品中厚壁菌門和擬桿菌門的總豐度無差異（P＞0.05），放線菌門和變形菌門的總豐度無差異（P＞0.05），說明巴氏殺菌發酵乳通過調節厚壁菌門和擬桿菌門、放線菌門和變形菌門內部的結構調節腸道菌群。對照組和YW11組的發酵乳與糞便共培養4、12 h后，厚壁菌門的相對豐度增加，其中YW11組的增加率分別為24.94%、4.86%；變形菌門的相對豐度降低，其中YW11組的減少率分別為2.11%、7.32%。Frank等[20]研究結果顯示，在IBD患者的腸道中厚壁菌門的豐度減少，變形菌門的豐度增加。對照組和YW11組的發酵乳與糞便共培養4、12 h后，擬桿菌門的相對豐度減少，其中YW11組的減少率分別為18.27%、13.51%；放線菌門的相對豐度增加，其中YW11組的增加率分別為7.36%、3.03%。放線菌門中含有雙歧桿菌益生菌，其豐度增加有可能對人體的健康有益。厚壁菌門包括產短鏈脂肪酸的菌屬和李斯特氏菌等致病菌，短鏈脂肪酸有利于抑制腸道中病原菌的生長，但李斯特氏菌是致病菌，所以，厚壁菌門豐度的增加并不能說明巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群存在有益的作用，只能說明巴氏殺菌發酵乳在門水平上調節了腸道菌群的結構。

2.2.3 YW11巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群組成的影響

為了研究巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群在屬水平上的調節作用，本研究對聚類到每個屬的菌群進行了統計分析。從圖5可以看到，對照組和YW11組主要增加了高豐度菌落的豐度，但是這種影響的利弊無法解釋，因此對每個門中含有的高豐度菌屬及常見菌屬進行統計分析。

圖5 巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群屬水平結構的影響Fig. 5 Classification and composition of bacterial populations at the genus level

2.2.3.1 厚壁菌門中菌群的組成

厚壁菌門中毛螺旋菌屬（Lachnospira）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和布勞特氏菌屬（Blautia）可以產生短鏈脂肪酸。其中，毛螺旋菌、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬可產生丁酸[21]，丁酸鹽是結腸上皮最好的氧化底物，占結腸細胞氧耗量的80%[22]；丁酸鹽還能通過降低環氧合酶、過氧化物酶的表達，減輕炎癥反應，抑制組蛋白去乙酰化及核因子κB活化，保護腸黏膜屏障[23]。丁酸水平降低參與了IBD炎癥的起始和加重過程[24]。Rehman等[25]研究發現CD患者腸道中毛螺旋菌屬、羅斯氏菌屬、瘤胃球菌屬和布勞特氏菌屬的含量減少。從圖6可知，YW11組相比空白組，在與糞便共培養4 h后，毛螺旋菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的相對豐度增加率分別為3.00%、0.55%、0.33%；在與糞便共培養12 h后，毛螺旋菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的相對豐度增加率分別為3.14%、0.54%、0.47%。說明巴氏殺菌發酵乳YW11能夠提高腸道中產丁酸菌屬的豐度，對人體的健康有益。

圖6 巴氏殺菌發酵乳對厚壁菌門中菌群在屬水平結構的影響Fig. 6 Composition of Firmicutes at the genus level

Christopher等[26]研究結果顯示CD患者腸道微生物中棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）的含量減少。本實驗中YW11組相比空白組，在分別與糞便共培養4 h和12 h后，棲糞桿菌屬相對豐度分別增加了0.41%、2.65%。Morgan等[27]研究結果顯示CD患者腸道微生物中考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）的含量減少。本實驗中YW11組相比空白組，在分別與糞便共培養4 h和12 h后，考拉桿菌屬相對豐度分別增加了0.06%、1.76%。Rajili?-Stojanovi?等[28]研究發現UC患者腸道微生物中鏈球菌屬（Streptococcus）含量增加。本實驗中YW11組相比空白組，在與糞便共培養4 h和12 h后，鏈球菌屬相對豐度分別減少了0.06%、0.14%。人感染丹毒絲菌屬（Erysipelotrichaceae）會引發一種“類丹毒”病，本實驗中YW11組相比空白組，在與糞便共培養4 h和12 h后，丹毒絲菌屬相對豐度分別減少了1.96%、2.10%。但是，Gevers等[29]研究了447 例新發CD的兒童患者和221 例健康人群糞便菌群，發現CD的兒童患者糞便菌群丹毒絲菌豐度降低。大部分菌屬豐度的變化趨于緩解IBD癥狀的方向，因此可說明巴氏殺菌發酵乳對調節人體腸道菌群有益。

腸道菌群中乳桿菌（Lactobacillus）可保持腸黏膜結構完整性，阻止致病菌及毒素等物質通過，保證腸壁屏障作用不受損害。有大量研究對厚壁菌門中乳酸菌的結果并不一致[30]。文獻[31]報道乳桿菌可以通過樹突狀細胞介導Treg細胞的分化，使Treg細胞分泌較高水平的白細胞介素（interleukin，IL）-10來發揮其對IBD的治療效應。IL-10可通過抑制IL-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎因子的釋放來保持腸道黏膜完整性，防止IBD的發生與惡化。因此，調節腸道菌群結構、維持腸道微生態的平衡、增強腸黏膜免疫功能在IBD的治療中就顯得尤為重要。腸道菌群中的Lactobacillus reuterii可將色氨酸轉變成3-吲哚甲酸，這種物質能夠刺激芳香族化合物受體的表達，進而減輕炎癥反應[32]。本實驗中YW11組與空白組相比，在與糞便共培養4 h和12 h后，乳桿菌屬相對豐度分別增加了0.13%、0.31%。

2.2.3.2 擬桿菌門中菌群的組成

與厚壁菌門不同，研究者對擬桿菌門豐度在IBD患者中豐度的變化得出不一致的結果，文獻[33]提示擬桿菌門在IBD患者的腸道菌群中豐度有所增加，但其多樣性減少；也有研究發現IBD患者腸道菌中擬桿菌屬（Bacteroides）豐度減少[34]；多數研究表明，擬桿菌屬是保護性細菌，可以通過下調炎性因子、刺激抑炎因子以及調節黏膜屏障功能和通透性等一系列機制保護宿主，避免其發生炎癥反應[35]。如圖7所示，相比空白組，在與糞便共培養4 h和12 h后，YW11組擬桿菌屬豐度分別增加了7.78%、4.10%。

圖7 巴氏殺菌發酵乳對擬桿菌屬豐度的影響Fig. 7 Effect of the pasteurized fermented milk on abundance of Bacteroidetes

2.2.3.3 放線菌門中菌群的組成

腸道菌群中的雙歧桿菌（Bifidobacterium）可保持腸黏膜結構完整性，阻止致病菌及毒素等物質通過，保證腸壁屏障作用不受損害[36]。雙歧桿菌有助于脂肪的消化吸收，一旦腸道內雙歧桿菌比例降低，則容易誘發炎癥反應，發生免疫缺陷性脂瀉病。Zhuang Xiaojun等[37]發現，中國腸易激綜合征患者腸道中雙歧桿菌豐度顯著減少[38]。在動物模型中，給予雙歧桿菌治療可減輕機體的炎癥水平，取得理想療效。如圖8所示，YW11組相比對照組，在與糞便共培養4 h和12 h后，雙歧桿菌屬豐度分別增加了18.09%、7.48%。有研究發現柯林斯菌屬（Collinsella）在CD患者回腸中的含量減少[39]。YW11組相比對照組，在與糞便共培養4 h和12 h后，柯林斯菌屬相對豐度分別增加了0.72%、0.80%。Wang Wei等[40]發現腸桿菌（Enterorhabdus）16S rRNA基因拷貝數的升高與硫酸葡聚糖誘導小鼠的IBD疾病活動性有關。Chassaing等[41]也得出一致的結論。YW11組相比對照組，在與糞便共培養4 h和12 h后，腸桿菌屬的相對豐度分別減少了0.01%、0.01%。

圖8 巴氏殺菌發酵乳對放線菌門中菌群在屬水平結構的影響Fig. 8 Composition of Actinobacteria at the genus level

2.2.3.4 變形菌門中菌群的組成

關于變形菌門中菌群與IBD關系報道的較少。Eun等[42]研究發現CD患者的腸道微生物中假單胞菌屬（Pseudomonas）的含量增加。在UC復發之前，正常厭氧菌埃希菌屬數量下降，同時，腸道微生物的多樣性減少[43]。如圖9所示，YW11組相比對照組，在分別與糞便共培養4 h和12 h后，假單胞菌屬的相對豐度減少，減少量分別為1.05%、1.05%；志賀埃希氏菌（Escherichia-Shigella）的豐度分別減少了0.14%、0.10%。

圖9 巴氏殺菌發酵乳對變形菌門中菌群在屬水平結構的影響Fig. 9 Composition of Proteobacteria at the genus level

2.2.4 物種β多樣性分析

為了研究消化后的巴氏殺菌發酵乳在腸道中的停留時間及巴氏殺菌乳樣品對腸道菌群組成的影響，對腸道菌群進行冗余分析。圖10所示，第1、2主成分對菌群的影響所能解釋的比例分別為43.7%、20.7%。培養時間、巴氏殺菌發酵乳環境因子和第1主成分的相關系數分別為0.659 7、0.801 9，其方向代表該因素對菌群影響的取向，長短代表對菌群影響的大小。培養4 h的樣品和培養12 h的樣品在培養時間影響因素的投影上長度一致，說明模型合理。菌群與培養時間、巴氏殺菌發酵乳環境因子射線的夾角及投影分別反應了培養時間因素、巴氏殺菌發酵乳環境因子對該菌群影響的相關性和大小。經過分析得出，71.43%的菌群與培養時間呈正相關關系，即隨著培養時間的延長，菌群的豐度增大；28.57%的菌群與培養時間呈負相關關系。45.71%的菌群與巴氏殺菌發酵乳環境因子呈正相關關系，即巴氏殺菌發酵乳能增加其豐度；54.29%的菌群與巴氏殺菌發酵乳環境因子呈負相關關系。

圖10 腸道菌群的冗余分析Fig. 10 Redundancy analysis of the intestinal flora

3 結 論

植物乳桿菌YW11發酵液對沙門氏菌、阪崎腸桿菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌有不同程度的抑制作用。將益生性植物乳桿菌YW11應用于巴氏殺菌發酵乳中能增加腸道微生態中菌群的豐富度和多樣性。在門水平，巴氏殺菌乳能增加厚壁菌門的豐度，減少變形菌門的豐度。在屬水平，整體看來，巴氏殺菌發酵乳能增加腸道中45.71%菌群的豐度，主要調節高豐度菌群；具體來看，巴氏殺菌發酵乳提高了產丁酸的毛螺旋菌屬、羅斯氏菌、瘤胃球菌屬及乳酸菌屬和雙歧桿菌的豐度，對人體的健康有益。同時，巴氏殺菌發酵乳增加了與緩解IBD炎癥相關的擬桿菌屬、糞棲桿菌、考拉菌屬、柯林斯菌屬的豐度，減少了與誘發IBD炎癥相關的丹毒絲菌屬、假單胞菌屬、志賀埃希氏菌的豐度。因此，巴氏殺菌發酵乳對腸道菌群結構有調節作用。本實驗結果可為益生性乳酸菌發酵乳的研發提供依據。