γ-氨基丁酸對雞蛋貯藏性能的影響

姜國川，閆曉慧，譚傳欣，孫洪蕊，張佳霖，劉學軍,*，王麗巖,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林工商學院財稅學院，吉林 長春 130507；3.吉林省農業科學院農產品加工研究所，吉林 長春 130033；4.吉林省輕工業設計研究院，吉林 長春 130021）

雞蛋營養價值較高，其蛋白質和氨基酸比例適合人體生理需要[1]，由于其具有高水分、高營養成分，因此在貯藏過程中易品質不斷劣化，并導致腐敗[2-4]。延緩雞蛋在貯藏期間的劣化速度以及提高雞蛋品質成為研究熱點。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種活性較高的天然氨基酸，主要通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧而產生，具有鎮靜安神、免疫調節、降血壓、抗疲勞、改善腦機能等多種生理功能，能參與體內多種代謝活動[5-6]。2009年我國衛生部將GABA確立為新資源食品，GABA在發酵食品中含量較高，Takeshima等[7]對GABA做了毒性研究評估，結果表明GABA非常安全，可以作為一種功能性食品。Yang Jiali等[8]在因感染鏈格孢而腐爛的西紅柿中注入不同質量濃度的GABA，發現當GABA質量濃度為100 μg/mL時，其對鏈格孢抑制效果最顯著，原因可能是適宜質量濃度的GABA可以激活抗氧化酶，進而導致鏈格孢細胞死亡；同時GABA轉氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶的關鍵基因在GABA處理后被上調，GABA代謝旁路的激活可能在GABA誘導植物免疫的抗性機制中起重要作用。Fait等[9-10]發現較高水平的GABA可以抑制細菌中hrp基因的表達。此外，GABA在環境中的應激反應與GABA的代謝旁路有關，GABA的代謝旁路在pH值調節、氧化還原調節、能量產生和維持碳/氮平衡、連接氨基酸代謝和三羧酸循環中起作用。Yu Chen[11]、Yu Ting[12]等研究發現，外源GABA可以通過啟動梨果實的防御反應來誘導其對青霉菌的抗性。

目前，國內外對GABA的研究多集中于其對食品保健功能特性的影響，有關外源GABA對貯藏期間雞蛋品質影響的研究鮮見報道。綜合以上研究結果，GABA可以參與蛋白質的代謝并具有一定的抑菌性，可以延緩食品的腐敗進程。雞蛋的腐敗變質主要由蛋白質的變化以及溶菌酶構型的改變引起。基于此，本研究擬向雞蛋中注入GABA，以蛋黃指數、哈夫單位（Haugh units，HU）為評價指標，研究GABA質量濃度、貯藏溫度對雞蛋貯藏性能的影響，并對雞蛋貯存期間卵轉鐵蛋白、卵白蛋白的含量變化進行分析；從而揭示GABA對雞蛋貯藏性能的影響，旨在為后續研究改善雞蛋貯藏性以及提高雞蛋品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GABA粉末 自制；GABA標準品、磷酸吡哆醛上海阿拉丁科技股份有限公司；732型強酸型陽離子交換樹脂（Na型）、卵白蛋白（優級純）、DEAE-Sepharose-Fast-Flow 北京夢怡美生物科技有限公司；低分子質量蛋白Maker、5×蛋白電泳上樣緩沖液、福林-酚試劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物有限公司；薄層層析板青島海洋公司。

1.2 儀器與設備

JY04S-3C凝膠成像儀 北京君意東方電泳設備有限公司；HD-A電腦采集器、CBS-B程控多功能全自動部分收集器、HD-7電腦高靈敏紫外檢測器 上海青浦滬西儀器廠；1260-6460液相色譜儀 美國安捷倫公司；層析缸上海信誼儀器廠；酶標儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA的制備及純化

采取兩段式發酵，先在pH 6.2、37 ℃適宜希臘魏斯氏菌Y24條件下培養16 h，將發酵液離心保留菌體，然后在pH 4.4、45 ℃條件下培養36 h，以積累更多的GABA。參考Tamura等[13]的方法，用離子交換色譜法對希臘魏斯氏菌Y24合成的GABA進行純化，然后收集含有GABA的洗脫液，于60 ℃條件下旋轉蒸發，至濃縮液體積幾乎不變時停止，趁熱加入100 mL無水乙醇，倒入燒杯中，立即再加入100 mL無水乙醇，不斷搖晃旋蒸瓶以減少損耗，倒入同一燒杯，室溫靜置醇沉24 h，然后抽濾，在干燥瓶內于60 ℃烘箱中烘至恒質量。

1.3.2 薄層層析法驗證GABA

參考王超凱等[14]的方法，驗證實驗制備的樣品是否為GABA。將薄層板在105 ℃烘箱中活化2 h，以5 g/L GABA標準品作對照，在展開相中展開，當移動至薄層板上端1 cm時取出薄層板，用茚三酮溶液進行噴霧，在80 ℃烘箱中顯色15 min，將出現的紅色斑點與對照組做對比。

1.3.3 GABA純度檢測

應用Berthelot比色法測定GABA純度[15]。

1.3.4 實驗分組

將雞蛋用10 mg/g新潔爾滅擦洗干凈后晾干，對接種部位進行一次消毒（體積分數2%碘酒）和二次消毒（體積分數75%酒精），用1 mL注射器將100 μL GABA或生理鹽水注射到雞蛋內，利用氧化鋅將針眼封住，然后用固體石蠟加固，在不同溫度條件下貯藏14 d。按注射的物質將實驗分為2 個對照組和4 個實驗組：對照1（未添加任何物質）、對照2（添加生理鹽水）和10、100、1 000、10 000 μg/mL GABA組，探討不同質量濃度GABA處理對雞蛋在37 ℃條件下貯藏14 d后新鮮度（HU值和蛋黃指數）的影響，得到最優GABA處理的質量濃度。再在最優質量濃度下，探討貯藏溫度（4、25、37 ℃）對GABA處理組和對照組（添加生理鹽水）雞蛋新鮮度的影響。

1.3.5 HU值、蛋黃指數的測定

分別參考董曉光[16]、趙美美[17]等的方法測定HU值和蛋黃指數。首先稱量雞蛋質量（m/g），再將雞蛋橫向破殼，將內容物置于水平玻璃板上，測量蛋黃邊緣與濃蛋白邊緣的中點高度，即為濃蛋白高度（h/mm），同時測量蛋黃高度及寬度，分別根據公式（1）、（2）計算樣品的HU值和蛋黃指數。

1.3.6 蛋清蛋白的分離純化

按照1.3.4節的實驗方法對雞蛋進行預處理，研究GABA對貯藏后（貯藏溫度37 ℃、貯藏時間14 d）雞蛋卵轉鐵蛋白、卵白蛋白質量濃度的影響。實驗分為100 μg/mL GABA處理組和對照組（添加生理鹽水）。參照麻小娟[18]的方法對蛋清蛋白進行分離純化。純化后蛋白質的確定：吸取各峰液體160 μL，加入40 μL 5×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），沸水浴8 min，于－20 ℃保存備用。用SDS-PAGE法檢測純化后的蛋白質種類。

1.3.7 蛋白質量濃度的測定

參照麻小娟[18]的方法，應用福林-酚法測定蛋白質量濃度。

1.4 數據統計與分析

實驗數據利用Excel軟件進行處理，利用Origin 8.5.1、Lane 1D軟件作圖，利用Statistic軟件進行HSD顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 純化后GABA的驗證結果

將純化后的GABA利用薄層層析法驗證，如圖1所示，純化后的GABA與GABA標準品純度相近。將經過732型強酸型陽離子交換樹脂層析柱純化結晶后的GABA經再次溶解后，測得純度為97.51%。

圖1 純化后的GABA與標準品的薄層層析結果對比Fig. 1 Comparison of thin-layer chromatogr results between purified GABA and standard

2.2 GABA對貯藏期間雞蛋新鮮度的影響

2.2.1 不同GABA質量濃度處理對雞蛋新鮮度的影響

圖2 不同質量濃度GABA對雞蛋新鮮度的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of GABA on egg freshness

HU值是衡量雞蛋新鮮度和雞蛋品質的重要指標，亦是目前國際上衡量蛋品質的常用方法。定義當HU值在60～100時，為新鮮雞蛋；在56～60時，為可食雞蛋；小于40時，為變質雞蛋[19]。由圖2可知，對照組1、2的HU值接近60，新鮮程度低。其原因是，鮮雞蛋中濃蛋白占總蛋白質量的50%～60%，隨著貯藏時間的延長，濃蛋白會逐漸水樣化，蛋白層之間的比例發生變化，濃蛋白逐漸變為稀蛋白，導致HU值降低[20-21]。隨著GABA質量濃度的升高，雞蛋的HU值呈先升高后降低的趨勢，當GABA質量濃度為100 μg/mL時，雞蛋HU值為71.51，顯著高于其他組，此時的雞蛋可以定義為新鮮雞蛋，與Yang Jiali等[8]的實驗結果一致。當GABA質量濃度為10 000 μg/mL時，雞蛋的HU值為52.18，顯著低于兩個對照組，說明10 000 μg/mL GABA會加速雞蛋的腐敗變質。因此GABA的代謝可能影響到了蛋清中特定蛋白質的代謝，延緩雞蛋腐敗變質，低質量濃度的GABA對這一特定蛋白質的影響較少，而質量濃度過高會起到相反作用，加速雞蛋的腐敗變質。

蛋黃指數也是衡量雞蛋品質的重要指標之一，蛋黃指數反映蛋黃的滲透壓和含水量，雞蛋內蛋黃膜的弱化和蛋清中的水分向蛋黃遷移導致蛋黃指數降低[22]。蛋黃指數大于0.3，定義為新鮮雞蛋；蛋黃指數大于0.2，定義為合格雞蛋，即蛋黃指數越大，雞蛋新鮮程度越高。如圖2所示，添加GABA的實驗組蛋黃指數值均高于2 個對照組，其中2 個對照組雞蛋貯藏后的蛋黃指數值接近0.2，可接受程度較低。當GABA質量濃度為100 μg/mL時，雞蛋的蛋黃指數最大，此時的雞蛋可以定義為合格雞蛋。綜上所述，當GABA質量濃度為100 μg/mL時，雞蛋的HU值與蛋黃指數最高，雞蛋新鮮程度最優。因此，選擇此質量濃度進行以下實驗。

2.2.2 不同貯藏溫度對雞蛋新鮮度的影響

如圖3A所示，貯藏時間相同時，不同組雞蛋HU值均隨著貯藏溫度的升高而降低。100 μg/mL GABA處理組HU值均高于對照組，在貯藏溫度為4、25、37 ℃時，對照組與實驗組的HU值分別為：85.20、86.91；64.90、72.28；61.83、71.50。Smith等[23]的研究結果表明，卵白蛋白巰基參與了蛋清稀化的過程；張銀等[24]的研究結果表明加熱會使卵白蛋白分子內α-螺旋、β-轉角向β-折疊轉化，分子間β-折疊結構的交聯使分子結構展開，暴露出疏水基團。實驗組在不同溫度貯藏條件下的HU值均高于對照組，原因可能是貯藏過程中，GABA促進了雞蛋中卵白蛋白的轉化，使實驗組卵白蛋白濃度低于對照組。

圖3 貯藏溫度對雞蛋HU值（A）和蛋黃指數（B）的影響Fig. 3 Effect of storage temperature on Hough unit (A) and yolk index (B) of eggs

如圖3B所示，蛋黃指數變化趨勢與HU值趨勢相似，隨著貯藏溫度的升高，兩組雞蛋蛋黃指數均呈現降低的趨勢；但相同貯藏溫度條件下，實驗組的蛋黃指數均高于對照組，說明100 μg/mL GABA對于改善雞蛋新鮮程度有一定的作用。雞蛋貯藏期間內，蛋清內的水分逐漸向蛋黃內遷移，蛋黃內的鹽則向蛋清內滲透，導致蛋黃體積不斷增大，蛋黃膜彈性變弱，當體積進一步增大會形成散蛋黃的現象。高溫有利于促進水分的滲透，從而使蛋黃的滲透壓降低，因此高溫條件下雞蛋的蛋黃指數下降速率較快[25]。實驗中發現高溫條件下，樣品產生貼殼現象的比較多；推測高溫對蛋黃破壞性較強烈，可能是高溫促進系帶變細甚至消失，導致蛋黃移位上浮，造成貼殼現象[20]。

2.3 GABA對雞蛋貯藏期間卵轉鐵蛋白及卵白蛋白含量的影響

2.3.1 DEAE-Sepharose-Fast-Flow層析結果

采用DEAE-Sepharose-Fast-Flow陰離子交換層析法對蛋清蛋白進行分離純化，分離時蛋白質因帶電荷的不同與樹脂結合程度不同，因此對蛋清蛋白進行氯化鈉濃度線性梯度洗脫，洗脫曲線如圖4所示。當洗脫液氯化鈉濃度為0 mol/L時，蛋清蛋白洗脫曲線上出現a蛋白峰，當洗脫體積達到100 mL時基線回歸到0，改變洗脫液的離子濃度，將結合的蛋白質逐步洗脫下來。當氯化鈉濃度為0.04 mol/L時，出現b蛋白峰，當氯化鈉濃度為0.06 mol/L時峰值最大，之后緩慢趨于平緩。

圖4 蛋清蛋白DEAE-Sepharose-Fast-Flow層析洗脫曲線Fig. 4 Elution curve of egg white protein by DEAE-Sepharose-Fast-Flow chromatography

2.3.2 卵轉鐵蛋白及卵白蛋白的SDS-PAGE結果分析

圖5 卵轉鐵蛋白和卵白蛋白分離純化的SDS-PAGE圖Fig. 5 SDS-PAGE of purified ovotransferrin and ovalbumin

圖5為蛋白分離純化的SDS-PAGE圖。對洗脫曲線的兩個峰利用Lane 1D軟件分析得到a、b峰蛋白質分子質量分別為74、46 kDa，與卵轉鐵蛋白、卵白蛋白的分子質量一致，說明a、b兩峰分別代表卵轉鐵蛋白和卵白蛋白，與佟平[26]的實驗結果一致。

2.3.3 GABA對貯藏后雞蛋卵轉鐵蛋白及卵白蛋白質量濃度的影響

圖6 GABA對貯藏期間雞蛋中卵轉鐵蛋白和卵白蛋白質量濃度的影響Fig. 6 Effect of GABA on the concentrations of otransferrin and ovalbumin in eggs during storage

如圖6所示，在相同貯藏條件下，100 μg/mL GABA處理組卵轉鐵蛋白質量濃度高于對照組，是對照組的1.12 倍。其原因可能是GABA促進了卵白蛋白向卵轉鐵蛋白的轉化，并且溫度越高卵轉鐵蛋白結合鐵后氫鍵作用越強，對熱的抵抗性越強[27]。

卵白蛋白質量占蛋清蛋白質量的54%～63%，是雞蛋中主要致敏原之一。在相同貯藏條件下，實驗組的卵白蛋白質量濃度低于對照組，僅為對照組的39%。綜上所述，GABA對雞蛋貯藏期間卵白蛋白質量濃度以及卵轉鐵蛋白質量濃度的變化有明顯影響。GABA的添加有助于貯藏期間卵白蛋白向卵轉鐵蛋白轉化，使卵轉鐵蛋白質量濃度較對照組高，而卵白蛋白質量濃度較對照組低。卵轉鐵蛋白是一種糖蛋白，在鐵的螯合及運輸過程中起關鍵作用，同時具有抗炎活性[28]。Kobayashi等[29]研究表明，卵轉鐵蛋白可以減輕小鼠經葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎癥狀。Wang Xiong等[30]通過模擬肽切割使用腫瘤壞死因子誘導的Caco-2細胞炎癥的體外模型來評估卵轉鐵蛋白及其二肽的抗炎作用，結果表明卵轉鐵蛋白衍生二肽通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號途徑發揮其抗炎活性。因此，GABA的添加有利于提高雞蛋貯藏期間的品質。

3 討 論

貯藏期間雞蛋蛋清蛋白濃度與雞蛋品質的變化關系是揭示雞蛋品質變化的本質因素。卵白蛋白與卵轉鐵蛋白是蛋清蛋白的重要組成部分。Alleoni等[31]的研究結果表明，經6 個月的貯藏，雞蛋卵白蛋白相對含量顯著升高。付丹丹等[32]對貯藏期間卵白蛋白相對質量濃度與雞蛋新鮮度指標之間的相關性進行分析，研究結果表明，雞蛋蛋黃指數、HU值與卵白蛋白質量濃度之間呈現極顯著負相關。金永國[27]、鄭彩燕[33]等研究表明，卵轉鐵蛋白是蛋清中的主要抗菌蛋白，能夠抑制蛋中的微生物生長，對雞蛋品質的保持起著積極的作用。本實驗對雞蛋貯藏期間卵白蛋白和卵轉鐵蛋白兩個蛋白組分進行研究，以期明確GABA處理對貯藏期間這兩個蛋清蛋白組分質量濃度以及雞蛋品質的影響。雞蛋在貯藏期間新鮮度降低，蛋清稀化，導致HU值與蛋黃指數下降。貯藏期間雞蛋品質的惡化主要是由蛋白質、溶菌酶構型變化[34]以及微生物增殖引起的。100 μg/mL GABA實驗組的雞蛋HU值、蛋黃指數高于對照組（未添加任何物質以及生理鹽水組），卵轉鐵蛋白質量濃度高于對照組（生理鹽水組），卵白蛋白質量濃度低于對照組（生理鹽水組），原因可能是GABA代謝旁路參與了三羧酸循環[35]，影響到蛋清中蛋白質的代謝，進而促進卵白蛋白向卵轉鐵蛋白的轉化，抑制溶菌酶構型的改變以及細菌的表達[8-12]，進而延緩雞蛋的腐敗進程。

4 結 論

本實驗研究了GABA對雞蛋貯藏性能的影響，通過比較不同質量濃度GABA處理雞蛋貯藏后新鮮度指標，篩選出最優GABA質量濃度。在此基礎上，探討貯藏溫度對最優GABA處理組和對照組（添加生理鹽水）雞蛋新鮮度的影響以及GABA對雞蛋在37 ℃條件下貯藏14 d后卵轉鐵蛋白、卵白蛋白質量濃度的影響。研究結果表明：GABA的添加可以提高雞蛋貯藏后的HU值、蛋黃指數以及卵轉鐵蛋白質量濃度，降低卵白蛋白質量濃度。因此，GABA能夠提高雞蛋的新鮮度，延緩蛋白質在貯藏過程中的變化，可以應用到其他食物中來減緩變質現象，或應用到飼料中提高雞蛋品質。